Диссертация (1139554), страница 26
Текст из файла (страница 26)
Данная опухоль считается иммуногенной, вследствие выявления спонтанной регрессии у 1-2% больныхи выступает моделью в различных исследованиях по иммунотерапии [31, 35].На фоне значимого увеличения TNF-α и IFN-α у больных меланомой иКРР, у пациентов из этих групп не было выявлено повышения уровня IL-2 в сыворотке крови. Концентрация IL-2 как у здоровых добровольцев, так и у онкологических больных приближалась к нулевым значениям.
Возможно, данное явление можно косвенно связать с активацией других факторов, которые опосредованно влияют на пролиферацию Тreg или с коротким межклеточным действиемданного цитокина, что требует дополнительных исследований.Оценка уровня IL-10 в сыворотке крови больных с КРР и меланомой показала низкую концентрацию данного цитокина, которая не превышала контрольных значений. Увеличение концентрации IL-10 в крови является неблагоприятным фактором прогноза, однако в данном исследовании у всех пациентовсывороточный уровень IL-10 не превышал 3 пг/мл.
IFN-γ и IL-10 являются информативными маркерами функциональной активности двух основных субпопуляций Тh. Противовоспалительный IL-10 является продуктом активации Тh2,обеспечивающих развитие гуморального иммунного ответа. Тh1 продуцируют127противовоспалительный цитокин IFN-γ, который стимулирует клеточные иммунные реакции. Увеличение в периферической крови онкологических больных уровня IFN-γ указывает на большую активацию клеточного звена иммунитета, возможно за счет NK-клеток.Как нами было показано у больных КРР абсолютное и относительноесодержание NK-клеток в периферической крови повышено. Именно они являются одним из главных продуцентов IFN-γ, благодаря чему NK-клетки играютважную роль в регуляции адаптивного иммунного ответа [28]. Для оценки цитокинопродукции NK-клетками у группы больных КРР была определена концентрация сывороточного IFN-γ.
У больных КРР концентрация сывороточногоIFN-γ была повышена в среднем в 6 раз (р<0,001) (таблица 20). У 40% больныхКРР выявлена IV стадия, с обнаружением отдаленных метастазов. СодержаниеIFN-γ превышало контрольные значения у всех больных. Таким образом показано, что у больных с КРР повышено как содержание NK-клеток, так и ихфункциональная активность за счет продукции цитокинов.При оценке взаимосвязи между уровнем цитокинов (IFN-γ и TNF-α)и долгосрочной выживаемостью больных с КРР, пациенты были разделенына две группы: первая – с выживаемостью больных менее 3-х лет, втораяболее 3-х лет.
При оценке сывороточного уровня цитокинов у первичныхбольных из двух групп было показано, что в 1 группе средняя концентрация TNF-α 19,5 пг/мл значимо превышает уровень цитокина во 2 группе10,9 пг/мл, а концентрация IFN-γ была достоверно выше более чем в 4 разаи достигала 31,6 пг/мл (р=0,036) (рис.
12).При анализе эффекторных субпопуляций лимфоцитов у пациентов из 2группы с высокой продолжительностью жизни было выявлено повышенное содержание NKT-клеток, NK-клеток и NKG2D+NK-клеток (p=0,01). Однако увеличение количественного содержания данных лимфоцитов не связано с повышением их функциональной активности и выработкой цитокинов.128IFN-γ*TNF-α*05101520Менее 3-х лет (n=12)2530354045Более 3-х лет (n=17)Рисунок 12. Концентрация цитокинов в сыворотке крови у больных КРР с различнойвыживаемостью в пг/мл.* различия показателей статистически достоверны относительно другой группы (p<0,05).Таким образом, показано, что увеличение числа эффекторных лимфоцитов ассоциировано с лучшими показателями выживаемости больных после традиционного специфического лечения, увеличение уровня цитокинов TNF-α иIFN-γ также играют немаловажную роль.
Зная негативный прогноз у пациентовс высокими показателями данных цитокинов, можно предположить, что многократное повышение сывороточного уровня TNF-α и IFN-γ является неблагоприятным фактором прогноза, а работа иммунной системы декомпенсирована и неэффективна. В данном случае влияние ингибирующих факторов превалируетнад положительным противоопухолевым эффектом иммуноцитов несмотря наих количественное преобладание.Полученные данные свидетельствуют в пользу косвенной активации противоопухолевого иммунного ответа у больных КРР.
В то же время, развитие опухоли у пациентов указывают на то, что этот ответ не эффективен.3.8. Получение рекомбинантного белка человека MICAРезультаты предыдущей части исследования продемонстрировали, чтопроисходит изменение экспрессии NKG2D у больных с различным уровнемsMICA. Было сделано предположение, что циркулирующий MICA может взаи-129модействовать с NKG2D.
Для того, чтобы это проверить и изучить влияние растворимых форм стресс-индуцированных молекул MICA на активность NKклеток мы провели серию экспериментов ex vivo. Для того чтобы проверить гипотезу анергии эффекторных клеток после взаимодействия NKG2D иNKG2DL нам необходим белок MICA в определенной концентрации и достаточном количестве.Существует два способа выполнения этой задачи – использование эндогенного (то есть присутствующего в организме человека MICA) натурального белкаи получение рекомбинантного белка. Первый способ решения данной задачиимеет ряд ограничений.
Во-первых, необходимо обеспечить получение достаточного количества биологического материала, содержащего целевой белок. В случае с MICA таким материалом может служить сыворотка крови онкологическихбольных. Однако следует учитывать, что концентрация белка в сыворотке кровилежит в диапазоне нанограмм на мл. Исходя их этого, для наработки требуемыхколичеств белка (концентрация белка 0,5 мг/мл) необходимо около 1-2 л сыворотки крови, что приблизительно соответствует 1/3-1/5 общего объема цельнойкрови в организме человека. В связи этим, использование натурального белка является нецелесообразным. Помимо этого, использование натурального белка сопряжено еще с рядом сложностей.
Во-первых, сыворотка крови представляет собой сложную композицию белков, что может потребовать введения дополнительных стадий очистки от примесей в конечном препарате для удовлетворения требованиям по физико-химическим свойствам MICA. Во-вторых, использованиеполученного из биологической жидкости человека вещества всегда сопряжено сриском контаминации патогенами, что в целом является причиной отказа от использования натуральных белков и их заменой на рекомбинантный препараты, впроцессе производства которого такой риск возможно свести к минимуму.Таким образом, на основании вышеприведенных аргументов, целесообразным решением для наработки белка является получение субстанции рекомбинантного белка в растворенном виде для его последующей очистки.130Существует несколько различных способов получения рекомбинантного белка.
К ним можно отнести химический синтез, биохимический синтезin vitro и использование клеток-продуцентов. Была проведена работа по получению рекомбинантного белка MICA (rhMICA) с использованием клеток-продуцентов. Доминирующую роль в получении биологически активных белков играют системы продукции белков на основе клеток E.coli, дрожжей и клеток китайского хомячка линии СНО. Выбор конкретного типа клеток-хозяина определяется требованиями к продуцируемому белку.
Системы экспрессии, основанные на использовании клеток E.coli, имеют ряд преимуществ, к которым можноотнести низкую стоимость разработки, высокий выход продукта, простой контроль процесса. Однако прокариотические системы экспрессии имеют ряд ограничений, связанных с корректным фолдингом белков и особенно – с пост-трансляционными модификациями, доступными только в клетках млекопитающих. Внастоящее время для получения MICA используются как прокариотические, таки эукариотические клетки-хозяина. Однако, белок, полученный в клетках прокариот, лишен модификации гликозилирования, при применении систем экспрессии на основе клеток млекопитающих белок подвергается пост-трансляционноймодификации.Клетки китайского хомячка линии СНО являются наиболее часто используемыми для продукции рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, предназначенных для использования в биомедицине.
Первым этапомпроцесса получения белка являлась наработка (получение) белка в растворенном виде для его последующей очистки.На основе имеющегося штамма-продуцента человеческого рекомбинантного белка MICA (линия CHO/hsMICA-3D) была проведена наработка,очистка и характеристика искомого белка. Для этого использовалиэкспрессионную конструкцию, представленную на рисунке 13.131Где кДНК молекулы MIC-A соответствует последовательности:aephslrynltvlsgdgsvqsgflaevhldgqpflrcdrqkcrakpqgqwaedvlgnktwdretrdltgngkdlrmtlahikdqkeglhslqeirvceihednstrssqhfyydgelflsqnleteewtmpqssraqtlamnvrnflkedamktkthyhamhadclqelrrylesgvvlrrtvppmvnvtrseasegnitvtcrassfyprniiltwrqdgvslshdtqqwgdvlpdgngtyqtwvatricrgeeqrftcymehsgnhsthpvpsgkvlvlqshwqРисунок 13.
Генетическая конструкция экспрессионной плазмиды белка MICA.В результате культивирования линии CHO/hsMICA-3D было собрано ибанкировано 16 л среды, содержащей искомый рекомбинантный белок MICA,которыйвдальнейшембылочищенметодомиммуноаффиннойхроматографии. В результате проведения 5 циклов очистки белка былополучено 50 мл раствора белка MICA и определена его концентрация, котораясоставила0,499мг/мл.Былаопределенамолекулярнаямассагликозилированной формы белка, электрофоретическая чистота, препарат былпроверен на стерильность.
Общее количество очищенного белка MICAсоставило 25 мг.По результатам измерений среднее значение рН раствора белка MICAсоставило7,3,допустимыезначениярН=6,7-7,8.Былаопределенамолекулярная масса гликозилированной формы белка MICA, котораясоставляет порядка 90 кДа (рис. 14).132Рисунок 14. Электрофореграмма очищенного белка MICA в денатурирующих (ден) инеденатурирующих (нативн) условиях.Электрофоретическая чистота продукта соответствует требованиям (рис.15). Препарат был проверен на стерильность.анти DED-MICAРисунок 15. Иммуноблот-анализ молекул MICA.Таким образом, в работе получен рекомбинантный белок человека, который соответствовал всем требованиям для использования его в экспериментах по оценке влияния растворимых лигандов NKG2D на активирующийрецептор NK-клеток.3.9.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
