Диссертация (1139554), страница 29
Текст из файла (страница 29)
25). Также значимоувеличилось количество эффекторов CTL и NKT-клеток. В периферическойкрови у 31% больных меланомой отмечалось снижение относительного числаВ-лимфоцитов и Th, у 34% наблюдалось повышение содержания Тreg, но значимых изменений не было. На третий день культивирования МНК у больныхмеланомой значимо повысилась экспрессия всех оцениваемых маркеров активации, как на лимфоцитах, так и на Т- и NK-клетках (рис. 25).147CD45RA45RORACD45ROCD69+Т-кл.CD69**CD38+Т-кл.Тh60Treg4030*20**Т-кл.7050*CD69+NK-клB-кл.80**CD38CD314+NK10*0***CD314CTLNKТ-кл.***NK-кл.HLA-DR+Т-кл.HLA-DRCD25 (IL2ɑ)0 day3 dayРисунок 25. Изменение поверхностной экспрессии маркеров активации на культивируемых лимфоцитах больных меланомой в среде с IL-2 сразу после выделения и на 3 день (в %).* значимое отличие количества клеток до и после активации МНК (p<0,05).Относительное содержание маркеров ранней активации CD38+ и CD69+ налимфоцитах составило 40,7±15,9% и 16,7±9,8%, соответственно.
Среднее содержание рецептора NKG2D на всех лимфоцитах составило 42,7±12,7%, а наNK-клетках – 14,5±9,1%, что несколько ниже, чем в группе больных КРР. На 3день культивирования в данной среде также наблюдалась тенденция к увеличению уровня экспрессии активационных маркеров и сохранению данного явления на протяжении всего времени культивирования лимфоцитов больных меланомой. Экспрессия активационного маркера CD25 увеличилась в 2,2 раза. Хотядругими авторами было показано, что добавление IL-2 к покоящимся лимфоцитам за 48 ч действия не индуцирует поверхностную экспрессию CD25 и не запускает пролиферативный ответ [36, 86]. Вероятно, ответ на IL-2 связан с иммуногенностью опухоли и индивидуальными особенностями клеток.
Экспрессия антигена HLA-DR увеличилась в 3,2 раза (т.е. маркера активации, повышение которого было очень значимо в группе меланомы, что не отмечалось приКРР), антигена СD314 в 1,6 раз, СD38 в 1,4 раза, CD69 в 4,3 раза, а CD69 на NKклетках в 3,6 раз (p<0,05) (рис. 25). Количество незрелых и «терминально-диф148ференцированных» CD45+RA+ клеток уменьшилось пропорционально увеличению доли зрелых CD45+RO+ клеток в культуре (рис. 25) [6, 8, 54]. Такая же тенденция наблюдается и в последующие дни культивирования.Таким образом, при данном способе культивирования прослеживаетсянарастание экспрессии активационных рецепторов, начиная от ранних маркеров и заканчивая более поздними. Данное явление закономерно и подтверждено нами с использованием метода проточной цитометрии и мониторингаэкспрессии маркеров активации на протяжении всего периода культивирования у онкологических больных КРР и меланомой в среде с IL-2.4.1.4.
Оценка цитотоксической активности лимфоцитов после активации in vitro в присутствии IL-2Анализ изменений активности лимфоцитов в процессе культивированияв среде с IL-2, который получили в результате изучения экспрессии маркеровактивации, был подтвержден с помощью изучения цитотоксической активности лимфоцитов на 3 день культивирования.Оценка цитотоксической активности культивируемых лимфоцитов поокрашиванию мертвых клеток-мишеней в красный цвет за счет Ethd-1, проникающего через перфорированную мембрану и флуоресценции ядра клеток,была проведена на 0, 1, 3, 5 и 7 день культивирования (рис. 26).Рисунок 26.
Фотография смеси активированных лимфоцитов и клеток-мишенейлинии К562 сразу после смешивания и через 6 часов.Фотографии получены с помощью автоматического анализатора IncuCyte Zoom(Essen BioScience, США). Зеленым (САМ) окрашены живые клетки-мишени К562.Красным (Ethd-1) мертвые клетки-мишени К562. Ув.: х200.149Показано, что в присутствии IL-2 (250 МЕ/мл) цитотоксическая активностьлимфоцитов проявляется с первых часов культивирования, т.к. уменьшается количество живых клеток, окрашенных САМ в зеленый цвет (рис. 27) и постепенновозрастает, достигая максимума через 60 часов культивирования (рис. 28). Показано, что цитотоксическая активность выше у АЦЛ (рис. 27 – 4-6) при соотношении мишеней и эффекторов 1:20. Если сравнивать показатели у здоровогодонора и онкологического больного, то можно заметить, что у больного (рис.27 – C, D) цитотоксическая активность меньше, чем у здорового добровольца(рис.
27 – А, В) особенно при низком соотношении мишеней и эффекторов.Рисунок 27. Динамика уменьшения количества живых клеток-мишеней (зеленая флуоресценция САМ) на протяжении 2-х часов в цитотоксическом тесте вкаждой лунке 24-луночного планшета в среде с IL-2 (250 МЕ/мл) сразу посленачала активации лимфоцитов (1-3) и на 3 день после активации (4-6).А, В – здоровый донор; C, D – больной меланомой;А, С – соотношение мишень:эффектор 1:20;B, D – соотношение мишень:эффектор 1:10.Отмечено, что после активации лимфоциты приобретают способностьэффективнее убивать клетки-мишени с первых часов после смешивания склетками-мишенями (рис.
28). Однако у предварительно активированныхМНК эта способность многократно выше. Максимальную цитотоксическуюактивность лимфоциты приобретают после 60 часов культивирования. Эти150данные хорошо соотносятся с изменением морфологии АЦЛ и увеличением ихпролиферативной активности, начиная с 3 дня культивирования. При дальнейшем культивировании цитотоксичность МНК сохраняется на высоком уровнена 5 и 7 день после начала активации. Было показано, что цитотоксическаяактивность эффекторных лимфоцитов повышается параллельно с увеличением поверхностной экспрессии маркеров активации на лимфоцитах, что согласуется с данными литературы [91].Рисунок 28.
Цитотоксическая активности лимфоцитов на 0 и 3 день после активациис IL-2 (250 МЕ/мл) (соотношение мишеней:эффекторов 1:40).Сравнивая активность лимфоцитов на 0, 1, 5 и 7 день культивирования, выявлено, что наименьшей цитотоксической активностью обладают нативные лимфоциты и лимфоциты с минимальной концентрацией IL-2 (31,25 МЕ/мл) (рис.29). Показано, что в первые часы после активации наилучшей цитотоксической активность обладают лимфоциты, культивируемые в присутствии IL-2 вконцентрации от 125 до 500 МЕ/мл (рис. 29).Таким образом, в процессе культивирования лимфоцитов онкологическихбольных в ППС с добавлением IL-2 было показано, что данная среда не толькоувеличивает пролиферативную активность лимфоцитов и их непосредственнуюиммунологическую активность, но и стимулирует дифференцировку этих клетокв более зрелые формы.151Рисунок 29.
Цитотоксическая активность лимфоцитов после активации c различнойконцентрацией IL-2 (31,25-500 МЕ/мл)(соотношение клеток-мишеней к эффекторам 1:20).Полученные в целом схожие данные о характерных изменениях в морфологии и фенотипе лимфоцитов больных с различными по нозологии опухолямиговорят о том, что вид (тип) онкологического заболевания существенно не влияетна процесс активации и пролиферации лимфоцитов in vitro.4.1.5. Влияние rhMICA на функциональную активность NK-клетокТакже в задачу данного этапа исследования входило изучение влиянияsMICA на функциональную активность NK-клеток человека in vitro.
СредиМНК часть Т-клеток экспрессируют NKG2D. Чтобы оценить вкладNKG2D+NK-клеток в лизис клеток-мишеней мы использовали NK-клетки вэкспериментах по блокировке активирующего рецептора NKG2D растворимым белком MICA в концентрации 1 мкг/мл. NK-клетки получали путем магнитной сепарации мононуклеаров здоровых доноров и больных меланомойсразу после выделения МНК (нативные NK-клетки) и после активации на протяжении 3 дней в присутствии IL-2 (ЛАК-клетки). Уровень экспрессииNKG2D определяли методом проточной цитометрии. Для того чтобы изучить152биологию NK-клеток и оценить роль NKG2D в процессе активации мы смешивали клетки-мишени линии К562 и эффекторы в соотношении 1:2 и 1:4(рис.
30).Рисунок 30. Цитолитическая активность NK-клеток и ЛАК-клеток больного меланомой (А, В) и донора (С, D) c растворимым белком MICA (1 мкг/мл). Автоматическое построение графиков в каждой экспериментальной точке, полученное с помощью IncuCyte Zoom (Essen BioScience, США). По оси абсцисс время постановки цитотоксического теста (от 1 до 2-х часов с интервалов в 30 минут в каждой точке).По оси ординат количество мертвых клеток-мишеней, окрашенных PI в красныйцвет. Цитотоксическая активность нативных NK-клеток (А, С) и активированныхIL-2 в течение трех суток ЛАК-клеток (B, D).В качестве мишеней использованы клетки линии К562.1 - 3 – соотношение мишеней и эффекторов – 1:44 - 6 – соотношение мишеней и эффекторов – 1:2Анализ проводили в трех повторах на каждую экспериментальную точкув течение 2-х часов.
Цитолитическую активность нативных и активированныхNK-клеток оценивали с помощью автоматического анализатора IncuCyteZoom (Essen BioScience, США) и анализа флуоресценции мертвых клеток-мишеней, окрашенных пропидием йодидом (PI).153На рисунке 30 представлен результат типичного эксперимента по уменьшению цитотоксической активности NK-клеток за счет блокирования рецептора NKG2D растворимым белком MICA. Было показано, что у здорового донора цитотоксическая активность NK-клеток в несколько раз выше (рис. 30D)чем у онкологического больного (рис.
30В). Инкубация NK-клеток в присутствие растворимого белка MICA приводила к снижению цитотоксической активности эффекторных клеток у больных меланомой в большей степени (рис.30А), чем у здорового донора (рис. 30С).Степень снижения цитотоксичности была различна у онкологических больных и варьировала в зависимости от функциональной активности NK-клеток.Однако наблюдалась одинаковая тенденция в уменьшении цитотоксической активности лимфоцитов у больных после блокирования белком sMICA. ЛАКклетки, не смотря на инкубацию с лигандом NKG2D, обладали более высокойцитотоксической активностью по сравнению с нативными NK-клетками. Полученные данные могут свидетельствовать в пользу проведения АИТ с помощьюАЦЛ т.к.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
