Диссертация (1139554), страница 31
Текст из файла (страница 31)
Учитывая их функциональные особенности, эти эффекторные клетки тоже могут быть использованы для целей АИТ злокачественных новообразований [17].Таким образом, доля лимфоцитов обладающих цитотоксической активностью (NK-, CTL и NKT-лимфоцитов) в популяции активированных МНК составила более 80%.
Было показано, что при добавлении двух интерлейкиновлимфоциты активируются in vitro в большей степени между 3 и 5 днём культивирования. Содержание маркера ранней активации CD69 начинает в несколько раз увеличиваться на всех лимфоцитах и на NK-клетках на 3 денькультивирования. Содержание раннего активационного маркера CD38 после 5дня культивирования на всех лимфоцитах возрастает в 2 раза, а на Т-клетках в3,5 раз. Количество всех активированных HLA-DR+ клеток к 6 дню увеличивалось в 2 раза.
Тенденция к увеличению экспрессии поздних активационныхмаркеров сохраняется до 14 дня культивирования.Для получения чистой популяции активированных NK-клеток из всехЦИК-клеток после культивирования было произведено выделение CD3CD16+CD56+ клеток с помощью магнитной сепарации и негативной селекции(рис. 34).159Рисунок 34. Морфология чистой субпопуляции активированных NK-клеток послемагнитной сепарации на 9 день культивирования в среде X-vivo20 с добавлениемIL-2 и IL-15. Без окраски. Ув.: х400.Доля NK-клеток в смеси культивированных лимфоцитов к 9 дню у большинства пациентов возросла почти в 2 раза и составила в среднем 30±8% отвсех МНК. В результате сепарации мы получили очищенную субпопуляциюактивированных NK-клеток, среди которых 98% клеток имели фенотип CD3CD16+CD56+ NK-клеток, экспрессирующих маркеры ранней (CD38, CD69) ипоздней активации (NKG2D, HLA-DR).
Данные клетки были использованыдля адоптивной иммунотерапии больных ПКР, а также для изучения цитотоксической активности NK-клеток.4.2.3. Оценка цитотоксической активности лимфоцитов после активации in vitro в присутствии цитокиновВ работе была проведена оценка цитотоксической активности лимфоцитов на 3 день культивирования в среде с IL-2 и IL-15 в различных соотношенияхмишень:эффектор. Было показано, что спонтанный цитолиз увеличился в среднем на 28% по сравнению с не активированными лимфоцитами (р<0,05), чтотакже достоверно выше чем в среде с IL-2 (рис.
35).На рисунке представлены данные интенсивности флуоресценции клеток-мишеней, окрашенных в красный цвет по включению Ethd-1 за счет перфорации мембраны, вызванной цитотоксической активностью лимфоцитовбез активации (0 день) и на третий день после культивирования в различныхсредах. Показано, что активность ЦИК-клеток в 1,6 раз выше, чем не активированных лимфоцитов и достоверно выше, чем при культивировании МНК160только с IL-2 (p<0,05).
Таким образом наглядно продемонстрировано, чтоЦИК-клетки обладают большей функциональной активностью по сравнениюс ЛАК-клетками.Рисунок 35. Увеличение количества мертвых клеток-мишеней (красная флуоресценции Ethd-1) после инкубации с лимфоцитами больного меланомой без активации(0 день) и через 3 дня культивирования в средах с IL-2 и в комбинации IL-2 и IL-15(соотношение мишень:эффектор 1:20).Наибольшей цитотоксической активностью (>90%) обладали ЦИК-клеткибольных после 3-х дней активации и инкубации с клетками-мишенями в соотношении 1:40 (рис. 36).Рисунок 36.
Цитотоксическая активность лимфоцитов больных без активации и через 3 дня культивирования в различных соотношениях мишень:эффектор.161Цитотоксичность в данном случае была в 8 раз выше, чем у не активированных клеток. Цитотоксическая активность нативных лимфоцитов начиналавозрастать после 5-10 часов культивирования и достигала максимума через 15часов. При соотношении мишеней и эффекторов 1:10 и 1:20 количество мертвыхклеток-мишеней практически не отличалось и составляло 63-68%.Оценивая эффекторную функцию ЦИК-клеток через разные промежуткивремени после активации было выявлено, что наибольшей цитотоксичностью обладают лимфоциты на 5 и 7 день культивирования в ППС с цитокинами (рис.
37).Рисунок 37. Цитотоксическая активность лимфоцитов на 0, 1, 5 и 7 день посленачала культивирования с IL-2 и IL-15(соотношение клеток-мишеней к эффекторам 1:20).Через 24 часа после активации наблюдается стремительный рост цитотоксической активности, который достигает максимальных значений через 42часа. Хотя морфология лимфоцитов при данных условиях культивированияизменяется, начиная с 3 дня активации. Наибольшей активностью по отношению к клеткам-мишеням линии К562 обладают ЦИК к 5 дню после начала активации. Этот эффект сохраняется на 7 день после активации.Показано, что в культуре лимфоцитов при данных способах культивирования больший прирост численности и активация эффекторных функций проявляется именно у цитотоксических лимфоцитов (более 80%), которые и могутбыть использованы для АИТ.162При сравнении пролиферативной активности, жизнеспособности ифункциональных характеристик клеточной субпопуляции МНК онкологических больных культивированных in vitro в присутствии только IL-2 или придобавлении комбинации цитокинов IL-2 и IL-15 было экспериментально подтверждено, что для получения большего количества АЦЛ, обладающих увеличенной цитотоксической активностью и высокой жизнеспособностью целесообразно выбирать полную питательную среду с добавлением двух указанныхинтерлейкинов в низких концентрациях и производить замену среды культивирования каждые 72 часа.Результаты данной части работы позволили разработать метод получения культуры АЦЛ с высокой жизнеспособностью, пролиферативной и противоопухолевой активностью.163Глава V.
РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКОЙ АПРОБАЦИИ МЕТОДААДОПТИВНОЙ ИММУНОТЕРАПИИЦелью данного этапа исследования была оценка безопасности и переносимости АИТ с использованием активированных цитотоксических лимфоцитов(АЦЛ), полученных на предыдущем этапе работы. Каждому из 79 больных,включенных в исследование, было проведено от одного до двенадцати курсовАИТ, каждый из которых длился от 20 дней до 3 месяцев в зависимости от количества полученных лимфоцитов и возможности больного приезжать на лечение.Первоначально нами был разработан протокол клинических испытаний,основанный на данных отечественных и зарубежных исследователей и результатах собственных научных работ. Каждый больной включенный в исследование был проинформирован о целях и методах, возможных реакциях и осложнения АИТ, а также уведомлен о своем праве отказаться от участия в исследовании.
Добровольцы не имели служебной или иной зависимости от лиц, имеющих отношение к проведению испытаний и (или) заинтересованных в егорезультате. Для исследования отбирались пациенты с диагнозом злокачественного новообразования, подтвержденным морфологически, получавшие илиполучающие лечение в Центре и при наличии критериев включения в исследование, описанных в материалах и методах.Все пациенты прошли комплексное обследование, которое включало стандартные лабораторные и инструментальные методы диагностики. Общее состояние каждого больного оценивали по 4-бальной шкале ECOG (ВОЗ) до и послепроведения первого курса АИТ (таблица 6).5.1.
Апробация метода АИТИммунотерапия АЦЛ была первоначально проведена 15 больным с разными онкологическими заболеваниями. В частности, 5-ти больным раком молочной железы (РМЖ), 4-м больным мелкоклеточным раком почки (ПКР), однойбольной плоскоклеточным раком легкого (РЛ), 2-м больным раком желудка, 2-м164больным раком пищевода и 4-м больным раком поджелудочной железы (таблица4). Средний возраст больных составил 56,2±13,5 лет.До начала АИТ 14 больных получали различные виды противоопухолевоголечения. Без лечения до АИТ оставалась 1 больная РМЖ.
Один самостоятельныйвид лечения предшествовал АИТ у 8 из 14 (57,1%) больных: только хирургическое лечение проведено 3 (21,4%) больным, только ЛТ – у 2 (14,3%) больных,только лекарственную терапию по различным схемам ранее получали 3 больных.Комбинированное лечение (хирургия, ХТ) и комплексное лечение получили по 3(21,4%) больных (таблица 4).
Пациентам была рекомендована АИТ после проведения базисного лечения или между курсами ХТ в связи с прогрессированием илис целью проведения АИТ в объеме комплексного лечения. Большинство включенных в данное исследование больных (12 (80%)) имели местно-распространенные или распространенные стадии заболевания (III-IV) (таблица 3, 21).Таблица 21Характеристика больных и результаты проведения АИТ№1234567ЗабоВремяБольные,Курсы Режимлева- Стадиянаблюдения,возрастАИТАИТниемес.В., 60РЛIV6моно20Т., 504моно12РМЖIVЕ., 791моно22РМЖIIIbШ., 591моно28ПКРIVЛ., 551моно28ПКРIVС., 661моно24ПКРIVБ., 572ТИТ+АИТ12ПКРIV89101112А., 53Ш., 47А., 45Ч., 79В., 25131415И., 63Ч., 46Л., 59РПЖРПЖРПЖРПЖРЖРЖРПРПIIbIVIVIVIIbIIbIVbIIIbИсход31813мономоноПХТ+АИТЛТ+АИТмоно2151824СБПБ, умерСБЧО, ПБСБСБСБ, умер(тромбоэмболия)умерПБЧО, умерумерПБ, умер222ПХТ+АИТЛТ+АИТЛТ+АИТ2127ПБ, умерСБПБ, умерПримечание: РЛ - рак легкого, РМЖ - рак молочной железы, ПКР - почечно-клеточныйрак, РПЖ - рак поджелудочной железы, РЖ - рак желудка, РП - рак пищевода.ТИТ – таргетная иммунотерапия, АИТ – адоптивная иммунотерапия, ПХТ – полихимиотерапия, ЛТ – лучевая терапия.
СБ – стабилизация болезни, ЧО – частичный ответ, ПБ – прогрессия болезни.165На момент начала АИТ регионарные или отдаленные метастазы диагностированы у 14 (93,3%) из 15 пациентов. Сроки наблюдения составили в среднем13,9±9,3 (от 2 до 28) месяцев, медиана 12 месяцев. Всем больным было суммарно проведено 40 курсов АИТ, в среднем по 2,7 курса. У 6 (40%) больныхАИТ проводилась в объеме адъювантной терапии. Больным ПКР АИТ проводилась чистой субпопуляцией выделенных активированных NK-клеток, которые были получены после негативной селекции и магнитной сепарации МНКактивированных ex vivo в присутствии IL-2 и IL-15 на протяжении 10 дней.
NKклетки вводили паравертебрально внутрикожно в 2 точки после хирургическогоудаления опухоли на 5, 7 и 10 дни после начала активации в общем количестве10 млн. Остальным больным РМЖ, РЛ, РПЖ, РЖ и РП проводили АИТ ЛАКили ЦИК-лимфоцитами.Введение биологического продукта проводили паравертебрально внутрикожно в несколько точек в зависимости от количества лимфоцитов и бесклеточного продукта (рис.
38).Рисунок 38. Введение активированных цитотоксических лимфоцитов внутрикожнопаравертебрально в несколько точек.Эффективность лечения оценивалась после каждого курса АИТ по критериям irRECIST. Оценку ответа на лечение проводили путем контрольных клинических исследований, ультразвукового обследования органов брюшной полости и забрюшинного пространства, малого таза, периферических лимфоузлов, рентгенографии органов грудной клетки. В некоторых случаях проводили плановую рентгеновскую компьютерную томографию. Дополнительно166оценивали сывороточный уровень молекул MICA и цитокинов, а также клеточный иммунный ответ, основанный на субпопуляционном составе лимфоцитови маркеров их активации.Проведенная оценка клинической эффективности АИТ у этой группыбольных раком позволила диагностировать ЧО у двух (13,3%) пациентов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
