Диссертация (1139554), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Блокирование рецептора NKG2D на NK-клеткахВ работе выполнен анализ влияния sMICA на поверхностную экспрессию рецептора NKG2D (CD314) на NK-клетках периферической крови здоровых людей и больных меланомой. В качестве источника sMICA использованчеловеческий рекомбинантный белок MICA в концентрациях 1, 5 и 10 мкг/мл.Было проведено исследование по кратковременному блокированию рецептора NKG2D рекомбинантным белком MICA в течение 30 минут. В работеиспользовали МНК больного меланомой сразу после выделения и активированные IL-2 и IL-15 на 4 день культивирования. Показано, что NK-клетки133больного меланомой экспрессируют NKG2D в 58%. После активации МНК inNKG2D+ NK-клетки (%)vitro количество NKG2D+NK-клеток увеличивается в 1,4 раза (рис.
16).100908070605040302010001510концентрация rhsMICA (мкг/мл)0 день4 деньРисунок 16. Ингибирование экспрессии рецептора NKG2D с помощью рекомбинантного человеческого белка MICA (rhMICA) на поверхности NK-клеток больногомеланомой сразу после выделения МНК (0 день) и после активации на 4 день(типичный пример).Было установлено, что кратковременная инкубация свежевыделенныхлимфоцитов больного с различными концентрациями rhMICA приводит к резкому снижению уровня поверхностной экспрессии NKG2D на NK-клетках с58,1% до 5,78%.
При активации лимфоцитов больного меланомой поверхностная экспрессии NKG2D на NK-клетках возрастает до 84,3%. При кратковременной инкубации активированных лимфоцитов с rhMICA в различных концентрациях снижения экспрессии NKG2D не произошло. Наоборот, прослеживается некоторая тенденция к незначительному увеличению NKG2D+ лимфоцитов среди субпопуляции NK-клеток (рис. 16).Экспрессия NKG2D выявлена на поверхности более 90% активированных NK-клеток, не смотря на инкубацию в присутствии рекомбинантногобелка в различных концентрациях, которые превышают максимально определенный уровень sMICA у онкологических больных в 103-104 раз. Возможно,это связано с тем, что нативные лимфоциты у больных меланомой более подвержены ингибирующему воздействию растворимых лигандов рецептораNKG2D. При активации лимфоциты изменяют свой потенциал и становятся134более устойчивыми к негативному воздействию, вероятно за счет предшествующего культивирования МНК в присутствии интерлейкинов на протяжении 4дней.
Цитокины могут выступать в качестве источников дополнительных сигналов активации. Данный факт свидетельствует в пользу того, что у активированных лимфоцитов максимально увеличивается экспрессия СD314. За счетэтого они обладают повышенной функциональной активностью и могут бытьиспользованы для АИТ даже у больных при наличии высоких концентрацийрастворимых форм молекул MICA.Также в работе было продемонстрировано, что растворимые формы молекул rhMICA способны приводить не только к блокированию NKG2D у больных меланомой и здоровых доноров, но и к увеличению доли NK-клеток в субпопуляции МНК и повышению экспрессии на их поверхности маркеров ранней (CD69) и более поздней активации (CD25) (рис. 17).количество клеток (%)504540*353025**20151050015концентрация rhMICA (мкг/мл)NK-клеткиCD25+NK10CD69+NKРисунок 17. Изменение экспрессии рецепторов NK-клеток и маркеров активацииCD25 и CD69 на поверхности NK-клеток здоровых доноров сразу после выделенияМНК и инкубации в присутствии различных концентраций рекомбинантного человеческого белка MICA (rhMICA).* достоверно значимые отличия количества клеток в зависимости от концентрацииrhMICA (p<0,05).Присутствие высоких концентраций белка rhMICA приводило к достоверному увеличению данных показателей по сравнению с суспензией МНК,135которые не были инкубированы с молекулами rhMICA.
Таким образом, показано, что обработка лимфоцитов рекомбинантным MICA значительно снижаетуровень рецептора NKG2D только у не активированных NK-клеток, что подтверждает ранее полученные нами данные в системе суспензионного белкаsMICA из супернатанта клеточной линии C1R-MICA и хорошо согласуется слитературными данными [3, 98, 160].Как было показано ранее, суточная инкубация эффекторов в присутствии супернатанта, содержащего sMICA, приводит к снижению экспрессииNKG2D и ингибированию их способности лизировать клетки-мишени линииК562.
С другой стороны, краткосрочная активации МНК здоровых доноровувеличивает поверхностную экспрессию маркеров активации, что отражает ихспособность к увеличению активности. Результаты данной работы подтверждают полученные данные об увеличении количества NK-клеток и повышении экспрессии маркеров активации в группе больных раком желудка, толстойкишки и меланомой с высоким уровнем сывороточного sMICA [3, 9].В данной экспериментальной системе у здоровых добровольцев продемонстрировано блокирующее действие высоких концентраций rhsMICA наэкспрессию NKG2D (рис.
18).101012,89%41,29%31021101034,21%101007,23%110210CD56-FITC31010210110210CD56-FITC31043,41%4,38%32184,55%14,32%010а101048,21%104101030,23%311,61%0104CD314-PECD314-PE104CD314-PE10104б7,65%001010110210CD56-FITC310410вРисунок 18. Снижение уровня поверхностной экспрессии NKG2D на CD3-CD56+ лимфоцитах здорового донора после инкубации лимфоцитов в присутствии высокихконцентраций rhMICA (типичный пример). Без обработки rhMICA (а), обработкамононуклеаров rhMICA в концентрации 1 мкг/мл (б) и 5 мкг/мл (в).Показано, что после активации МНК в присутствии IL-2 и IL-15 они обладают повышенной экспрессией NKG2D, которая не экранируется в полной136мере, несмотря на присутствие rhsMICA.
Возможно у активированных лимфоцитов рецепторы приобретают другую конформацию (т.е. 3D структуру) гдесайты связывания расположены по-иному, чем у клеток без активации, но этотребует отдельного изучения.Подтверждено, что активация лимфоцитов in vitro может являться однимиз подходов к иммунотерапии опухолей. Полученные экспериментальные данные указывают на наличие опосредованных NKG2D механизмов регуляциифункций естественных киллеров при взаимодействии с клетками-мишенями,экспрессирующими лиганды NKG2D и растворимыми формами этих молекулкак у здоровых доноров, так и у онкологических больных.В экспериментальной модели нами показано, что резкое повышениеуровня sMICA в культуральной среде приводит к снижению уровня одного изосновных активирующих рецепторов ЦЛ – NKG2D, или его лигандному экранированию, то есть перекрыванию сайтов связывания для антител.
Это явлениепредполагает участие сывороточных молекул sMICA во взаимодействии сосвоим рецептором и возможной супрессии противоопухолевого иммунного ответа, но не за счет ингибирования функции, а за счет активации и блокадыNKG2D. В организме это может происходить за счет дистанционной активацииNKG2D+ лимфоцитов, которые взаимодействуют с сывороточными формамибелка MICA у онкологических больных, что подтверждено нами в исследованиипо увеличению синтеза NK-клетками цитокинов. Дистанционная активация лимфоцитов приводит к преждевременному истощению пула NKG2D+ лимфоцитови их анергии.
Увеличение экспрессии CD95 на данных цитотоксических лимфоцитах подтверждает факт готовности к апоптозу длительно активированныхлимфоцитов.Выявленная взаимосвязь между уровнем sMICA, повышением содержания Treg и CD95 и хронической активацией иммунитета за счет увеличенияэкспрессии ряда ранних и поздних маркеров указывает на более выраженнуюиммуносупрессию у онкологических больных по сравнению с пациентами гдевсе эти показатели не выходят за границы допустимых норм.
Показано, что137многократное повышение сывороточного уровня цитокинов TNF-α и IFN-γ убольных КРР является неблагоприятным фактором прогноза, а работа иммуннойсистемы декомпенсирована и не эффективна. Это подтверждают данные клинических наблюдений. У больных меланомой наоборот можно отметить снижение цитокинопродукции, что подтверждает различные механизмы формирования противоопухолевого иммунного ответа, несмотря на что, все они ведут ки его несостоятельности.138Глава IV. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ДЛИТЕЛЬНОГОКУЛЬТИВИРОВАНИЯ И АКТИВАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ ДЛЯАДОПТИВНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ4.1.
Культивирование лимфоцитов in vitro в присутствии IL-2Результаты исследования иммунитета у онкологических больных, представленные в предыдущей главе работы, демонстрируют, что у таких пациентов присутствую нарушения в распознавании опухоли, как патогенногоагента, а также и в формировании правильного и результативного эффекторного звена иммунного ответа. Одним из направлений развития онкоиммунологии, имеющих целью коррекцию данных состояний, является терапия цитотоксическими лимфоцитами, которые получают от больного или донора, и дополнительно индуцируют их активацию in vitro. Данное направление, по сути,является, заместительной терапией, нарушенного иммунного ответа у онкобольных.
Однако для проведения такой терапии, необходима технология получения клеток эффекторного звена иммунного ответа, которые станут основным терапевтическим агентом данного метода лечения. Решению этой проблемы посвящена данная глава исследования.4.1.1. Оценка пролиферативной активности и морфологии лимфоцитовВ своей работе на этапе внедрения и клинической апробации метода мы состорожностью подошли к проблеме возникновения побочных эффектов, причиной которых являются большие дозы цитокинов, обуславливающих нежелательные явлений при проведения АИТ, о чем свидетельствуют литературные данные.С этой целью, мы изучили влияние различных концентраций IL-2, а такжекомбинации цитокинов IL-2 и IL-15 на процессы активации МНК.
Были исследованы изменения морфологии, пролиферации, жизнеспособности, фенотипакультивируемых лимфоцитов и их цитотоксическая и секреторная активность.Первоочередной задачей исследования была разработка критериев оценкикачества получаемого терапевтического продукта. Были изучены морфологические изменения ЛАК-клеток при культивировании и определена динамика139нарастания экспрессии маркеров активации в культуре МНК, а также проведена оценка пролиферативной активности в зависимости от среды культивирования.Для активации лимфоцитов, выделенных по стандартной методике наградиенте плотности фиколла, первоначально использовали IL-2 в различныхконцентрациях от 31,25; 62,5; 125; 250 до 500 МЕ/мл.В работе проводили анализ пролиферативной активности, жизнеспособности и цитотоксической активности лимфоцитов с использованием автоматического анализатора IncuCyte Zoom (Essen BioScience, CША), который размещалсяв CO2 инкубаторе и производил постоянную круглосуточную фотосъемку растущей культуры лимфоцитов в заданных лунках через определенные промежуткивремени.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
