Диссертация (1139554), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Выявление дисбаланса лимфоцитов у больных КРРВ данном исследовании нами был также оценен фенотип лимфоцитовпериферической крови и маркеры активации в группе из 38 первичных больных с КРР, у которых периферическая кровь для исследования была забранадо проведения специфического лечения.
Использовали ту же панель СD маркеров, что и для группы больных меланомой. Изучение закономерностей субпопуляционного состава лимфоцитов у различных нозологических групп позволит дополнить наше представление о роли иммунной системы в канцерогенезе. В том числе о взаимосвязи экспрессии NKG2D и уровне молекул MICAпри лиганд рецепторном взаимодействии.Сравнительный анализ основных субпопуляций лимфоцитов был проведен с референсными значениями (таблица 17).
В группе больных КРР у 31% па-117циентов отмечалось снижение относительного числа В-лимфоцитов. Доля субпопуляций Т-лимфоцитов и среднее количество CTL находились в пределах референсных значений.Таблица 17Фенотипическая картина лимфоцитов и маркеров активации убольных колоректальным ракомФенотип лимфоцитовЛимфоциты (CD45)В-лимфоциты (CD20)Т-лимфоциты (CD3)Т хелперы (CD4+CD3+)Treg (CD4+CD25bright)CTL (CD3+CD8+)NKT-клетки(CD16+CD56+CD3+)NK-клетки (CD16+CD56+CD3-)Активированные Т-лимфоциты (CD3+HLA-DR+)Активированные лимфоциты(HLA-DR)Альфа цепь рецептора IL-2(CD25)CD314 (NKG2D)NKG2D+NK-клеткиCD38+Т-клеткиCD38CD69CD69+NK-клеткиCD95 (Fas/APO-1)CD95+Т-клетки%29,0±10,56,5±3,569,4±10,8*42,7±9,06,5±3,727,5±8,9*109 кл/л1,94±0,830,13±0,111,35±0,610,82±0,390,12±0,070,53±0,29Референсныезначения% (*109 кл/л)19-37/1,2-2,57-17/0,11-0,3861-85/0,95-2,0835-55/0,58-1,341,6-5,8/0,01-0,0819-35/0,37-0,972,2±1,90,05±0,050,5-6/0,01-0,1722,9±10,4*0,38±0,24*8-19/0,12-0,3710,0±4,90,2±0,17-11/0,11-0,4018,8±6,20,4±0,28-18/0,12-0,508,6±5,10,2±0,12-9/0,04-0,1453,2±9,820,1±9,1*10,3±6,6*31,3±12,221,1±10,98,9±5,0*46,0±16,436,2±11,10,9±0,50,32±0,21*0,23±0,250,64±0,520,36±0,220,16±0,160,80±0,590,62±0,4131-54/0,6-1,47-12/0,11-0,459-15/0,2-0,520-50/0,5-1,310-30/0,2-0,73-10/0,1-0,223-60/0,6-1,412-50/0,3-1,3Количество клетокПримечания: * различия показателей статистически достоверны относительно группы больных меланомой (таблица 17) (р<0,05) (критерий Манна-Уитни).С другой стороны, у 56% больных наблюдалось повышение абсолютногои у 81% больных относительного содержания Тreg.
Возможно, данные изменения связаны с увеличением иммуносупрессивного воздействия Тreg у больных сдиссеминированными формами рака, которых в данной группе насчитывалось11818 человек (47,4%). Более чем у половины пациентов (62%) было повышено содержание NK-клеток. Среднее содержание этой субпопуляции лимфоцитов убольных в два раза превышало показатель, полученный у группы здоровых доноров – 22,9±10,4% против 11,6±2,9% (р<0,05). Соответственно у данных больных выявлено увеличение доли NKG2D+ NK-клеток и всех NKG2D+ клеток, какбыло описано выше (таблица 14) (р<0,05). Показано, что NKG2D экспрессируется более чем на 87,9% NK-клеток у больных КРР и на 5% выше чем у доноров.Относительное и абсолютное число активированных HLA-DR+ лимфоциты были повышены у половины (50%) больных КРР, а средние значения достоверно превышали показатели в контрольной группе, которые составили14,9±2,6% и 0,28±0,11*109 кл/л.Среднее количество CD25+ лимфоцитов превышало референсные значения у 90% пациентов и значимо отличалось от группы доноров (5,9±1,8%)(р<0,05).
Также у больных с КРР наблюдалось увеличение доли CD69+NKклеток до 8,9±5,0% по сравнению с донорами (5,5%±2,4%) (р<0,05).Значимых отличий между экспрессией CD38 и CD95 на лимфоцитах и Тклетках у больных КРР и доноров обнаружено не было.Сопоставление результатов фенотипирования лимфоцитов с аналогичными показателями у больных меланомой выявило, что у больных КРР отмечается не только увеличение содержания NK-клеток, но и активированныхNKG2D+ NK-клеток и CD69+ NK-клеток (р<0,05). Экспрессия активирующегорецептора NKG2D (CD314) была выявлена на 90% NK-клеток, а рецептораCD69 на 43% NK-клеток, что превышает данные показатели у группы больныхмеланомой (таблица 16, 17).
С другой стороны, у больных КРР было обнаружено значимое снижение Т-лимфоцитов и активированных CD38+Т-клеток(р<0,05). В свою очередь группе больных меланомой более свойственно повышение количества лимфоцитов с фенотипом CD3+CD38+, CD38+, CD3+CD95+,CD95+ (таблица 16). Содержание раннего активационного маркера CD38 навсех лимфоцитах повышено за счет субпопуляции Т-клеток.
Он обеспечиваетпроводимость сигнала активации в Т-клетки, а также служит маркером зрелых119клеток и, также как маркер апоптоза Fas (CD95), отражает степень зрелости иактивности клеточного звена иммунитета [56, 58]. Экспрессия CD95 на всехклетках и на Т-лимфоцитах в группе больных меланомой также нескольковыше на 6% и 7% аналогичных показателей у больных КРР.Полученные данные свидетельствуют в пользу преобладания и большейактивации NK-клеток у больных КРР и преобладании доли Т-клеток и их активации у больных меланомой.
Однако, учитывая наличие опухоли и распространенность процесса у онкологических больных, можно предположить недостаточную эффективность данных путей противоопухолевой защиты и преобладание других иммуносупрессивных механизмов.На основе полученных данных, можно заключить, что для большинствапациентов двух групп характерно повышение относительного и абсолютного содержания Тreg и HLA-DR+ лимфоцитов.
Вероятно, это связано с усилением пролиферативного ответа NK- и Т-лимфоцитов, возможно через CD25 в ответ на выработку эндогенного IL-2 у больных [31, 56]. Данные изменения характеризуютв большей степени активацию Т-клеток у больных меланомой и NK-лимфоцитову больных КРР. Взаимодействие IL-2 с высоко аффинными рецепторами на ЦЛявляется тем ключевым моментом, который обеспечивает запуск сигнальных событий, непосредственно регулирующих вступление покоящихся лимфоцитов вклеточный цикл. Повышение экспрессии молекул HLA-DR на клеточной мембране можно связать не только с поздней, но и с длительной активацией клеток,т.е. HLA-DR позитивные лимфоциты продолжительно циркулируют в крови онкологических больных, что говорит о длительности заболевания.
Кроме этого,HLA-DR может экспрессироваться на различных субпопуляциях лимфоцитов(CD4+, CD8+, NK-, NKT-, Treg) при активации. Также через рецепторы HLA-DRреализуется механизм апоптотической гибели клеток, обеспечивая тем самымограничение иммунного ответа у онкологических больных.120Однако, высокий уровень лимфоцитов-супрессоров и наличие злокачественного образования, говорит о несостоятельности противоопухолевого иммунного ответа у онкологических больных и преобладании механизмов, позволяющих опухолевым клеткам ускользать из-под иммунного надзора.Данные результаты могут служить обоснованием для расширения общепринятой панели маркеров при фенотипировании лимфоцитов и оценки субпопуляционного состава лимфоцитов крови у онкологических больных.
Несмотря на активное исследование особенностей клеточного иммунитета призлокачественном росте, многие детали пока остаются недостаточно изученными, что и диктует необходимость дальнейшего решения этой проблемы.3.6. Взаимосвязь между экспрессией NKG2D и уровнем sMICAВзаимодействие молекул sMICA со своим рецептором может дистанционно блокировать последний, что должно приводить к снижению уровня его экспрессии на лимфоцитах периферической крови.
Для лучшего понимания взаимосвязи между концентрацией sMICA и уровнем экспрессии NKG2D была проведена сравнительная оценка этих показателей у больных с низким, средним и высоким содержанием sMICA. В данной работе использовали периферическуюкровь 42 больных меланомой и 52 больных КРР из числа 200 первичных больных. Контрольную группу составили 20 здоровых добровольцев. Оценку поверхностной экспрессии NKG2D на Т-лимфоцитах и NK-клетках проводили с использованием флуоресцентно меченых антител.Как было показано ранее, у большинства больных меланомой и КРР уровень sMICA значительно превышает контрольные значения, что может служитьодним из диагностических маркеров (р<0,05).
Для проведения анализа и оценкисодержания sMICA в сыворотке крови больных использовали готовый набор реагентов (Abcam, США). Было показано, что среднее содержание sMICA при меланоме составило 3214,0±943,4 пг/мл, в группе больных КРР несколько выше –3642,5±681,8 пг/мл (р=0,1).121Применяя метод твердофазного сэндвич ИФА и готовый набор реагентовфирмы Abcam, в котором молекулы MICA выявлялись сразу по нескольким эпитопам, показано, что значения концентраций sMICA в 15-20 раз выше, чем прииспользовании другого набора для ИФА фирмы R&D, в котором методом непрямого ИФА иммобилизованные на пластике антитела к sMICA связываются с внеклеточными доменами молекул MICA с последовательностью из 24-307 аминокислот.
Такая же последовательность аминокислот используется в стандартах.При использовании готовых наборов фирмы Abcam анти-MICA антитела нанесены на пластик фирмой производителем, в наборе фирмы R&D антитела наносились самостоятельно исследователем в процессе пробоподготовки, что делаетпроцесс более многошаговым и увеличивает время постановки теста.Также перед внесением образцов исследуемых сывороток стандартнойпроцедурой считается добавление сыворотки крупного рогатого скота или бычьего сывороточного альбумина для устранения неспецифики, что было сделано по рекомендации производителя фирмы R&D.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
