Диссертация (1139554), страница 19
Текст из файла (страница 19)
По стандартным образцам белка MICA строили калибровочную кривую зависимостиконцентрации белков MICA (пг/мл) от величины оптической плотности придлине волны 450 нм, с помощью которой вычисляли концентрацию белка в исследуемых образцах.Определение концентрации молекул MICA в сыворотке крови больных дои на этапах ИТ проводили по инструкции с помощью набора реагентов MICA91Human ELISA Kit (Abcam, США). Для этого готовили раствор 1 разведением исходного концентрата ФСБ в 20 раз и в 5 раз разводили дистиллированной водойраствор для разбавления образцов.
Остальные растворы были готовы к использованию. Вносили во все опытные лунки, кроме первой, по 100 мкл раствора дляразведения образцов. В первую лунку вносили 200 мкл калибровочного образцас максимальным содержанием MICA 5000 нг/мл. Во вторую и остальные лункипереносили по 100 мкл калибровочного образца из предыдущей лунки. Внесениепроводили в дублях, начиная с верхних лунок первых двух стрипов. В следующую пару лунок вносили по 100 мкл контрольных образцов без сыворотки.
Востальные лунки вносили по 100 мкл исследуемых образцов сывороток. Стрипызаклеивали пленкой и инкубировали при комнатной температуре в течение 2,5часов. По окончании инкубации с помощью автоматического вошера промывалилунки планшета 4 раза раствором 1, чередуя аспирацию и немедленное заполнение лунок каждого стрипа. В каждую лунку вносили не менее 300 мкл жидкостив процессе каждого цикла промывки.
Далее в лунки планшета вносили по 100мкл конъюгата №1 (Biotinylated MICA Detection Antibody). Стрипы заклеивалипленкой и помещали в шейкер. Инкубировали 60 мин при температуре 18-25°С.По окончании инкубации промывали планшет 4 раза, как описано выше. В лункипланшета вносили по 100 мкл конъюгата №2 (HRP-Streptavidin solution). Стрипызаклеивали пленкой, помещали в шейкер и инкубировали 45 мин при температуре 18-25°С. По окончании инкубации снова промывали планшет 4 раза. Вносили во все лунки по 100 мкл раствора ТМБ. Планшет выдерживали в защищенном от света месте в течение 25-30 мин при температуре 18-25°С.
Далее вносиливо все лунки по 50 мкл стоп-реагента (2N раствор серной кислоты) и сразу проводили измерение оптической плотности при длине волны 450 нм на фотометреChroMate 4300 (Awareness Technology, США).Для определения функциональной активности культивируемых клетокпроизводили оценку концентраций IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-α, IFN-γ и TNFα в бесклеточном продукте (супернатанте) на 3 день культивирования в присутствии различных концентраций IL-2 (0, 50, 125 и 250 МЕ/мл) с помощью92ИФА с использованием набора реагентов «интерлейкин-2-ИФА-БЕСТ», «интерлейкин-4-ИФА-БЕСТ», «интерлейкин-6-ИФА-БЕСТ», «интерлейкин-10ИФА-БЕСТ»,«альфа-ИФН-ИФА-БЕСТ»,«гамма-ИФН-ИФА-БЕСТ»и«альфа–ФНО-ИФА-БЕСТ» (Вектор Бест, РФ).
ИФА проводили по инструкции. Метод определения основан на трехстадийном «сэндвич»-варианте твердофазного ИФА с использованием моно- и поликлональных антител к цитокинам человека.Предварительно готовили раствор 1 разведением исходного концентратаФСБ-Т в 25 раз. Остальные растворы были готовы к использованию. В дубляхвносили во все опытные лунки по 100 мкл раствора для разведения образцов.Внесение 100 мкл калибровочных образцов начинали с верхних лунок первыхдвух стрипов. В следующую пару лунок вносим по 100 мкл контрольных образцов.
В остальные лунки вносили по 100 мкл исследуемых образцов. Стрипы заклеивали пленкой и инкубировали при температуре 18-25°С или 37°С в течение120 мин в термостатируемом шейкере с частотой вращения 700 об/мин. По окончании инкубации снимали липкую пленку. С помощью вошера промывали лункипланшета 5 раз раствором 1, чередуя аспирацию и немедленное заполнение лунок каждого стрипа. В каждую лунку вносили не менее 350 мкл жидкости в процессе каждого цикла промывки. Далее в лунки планшета вносили по 100 мклконъюгата №1. Стрипы помещали в шейкер и инкубировали 60 мин при температуре 18-25°С или 37°С при 700 об/мин. По окончании инкубации промывалипланшет 5 раз, как описано выше.
В лунки планшета вносили по 100 мкл конъюгата №2. Стрипы помещали в шейкер и инкубировали 30 мин при температуре18-25°С при 700 об/мин. По окончании инкубации промывали планшет 5 раз, какописано выше. Вносили во все лунки по 100 мкл раствора ТМБ. Планшет выдерживали в защищенном от света месте в течение 25-30 мин при температуре 1825°С или 37°С. Вносили во все лунки по 100 мкл стоп-реагента (2N раствор серной кислоты) и через 2-3 минут проводили измерение оптической плотности придлине волны 450 нм на фотометре ChroMate 4300 (Awareness Technology, США).93По стандартным образцам строили калибровочную кривую, с помощью которойвычисляли концентрацию белков в исследуемых образцах сывороток крови.2.2.7.
Определение показателей информативности выявленияsMICA методом ИФАПри интерпретации полученных результатов по выявлению молекулMICA в сыворотке крови онкологических больных и определении вероятностидействительного наличия патологии при положительном результате илинадежности исключения патологии при отрицательном результате в работеоценивали на основе определения чувствительности, специфичности, предсказательной ценности (прогностичность) положительных или отрицательныхрезультатов тестов в соответствии с Правилами оценки клинической информативности лабораторных тестов ГОСТ Р 53022.3-2008 (таблица 9).Таблица 9Критерии оценки диагностической ценности методаКритерийПоложительный результатОтрицательный результатАприорная вероятностьболезниКлиническаячувствительностьКлиническая специфичностьПрогностичность положительного результатаПрогностичность отрицательного результатаДиагностическаяэффективность теста(точность)Болезнь присутствуетБолезнь отсутствуетa - истинно положительb - ложноположительныйныйc - ложноотрицательный d - истинно отрицательный(a + c) / (a + b + c + d) = доля больныхв обследуемой группеa / (a + c) = доля истинно положительныхрезультатов в группе больныхd / (b + d) = доля истинно отрицательныхрезультатов в группе здоровыхa / (a + b) = доля истинно положительныхрезультатов среди всех положительных результатовd / (c + d) = доля истинно отрицательныхрезультатов среди всех отрицательных результатов(a + d) / (a + b + c + d) = доля истинныхрезультатов среди всех результатов тестаДля характеристики информативности диагностических методов исследования служат объективные параметры, которые называются операционнымихарактеристиками исследования (теста).
К основным операционным характеристикам метода диагностики относятся: чувствительность и специфичность.94Клиническая информативность: способность лабораторного теста на основе информации, полученной в результате исследования, определенного аналита в биологическом материале, характеризовать состояние внутреннейсреды организма у обследуемого лица и выявлять патологические отклонения.Клиническая (диагностическая) специфичность лабораторного теста: числолиц, правильно классифицированных по результатам исследования как не находящихся в определенном состоянии, деленное на число всех лиц, не находящихсяв определенном состоянии. Число истинно отрицательно классифицированныхлиц, деленное на сумму клинически правильно отрицательно классифицированных и клинически ложноположительно классифицированных.Клиническая (диагностическая) чувствительность лабораторного теста:число лиц, точно классифицированных по результатам исследования как находящихся в определенном состоянии, деленное на число всех лиц в этом состоянии.
Клинически истинно положительно классифицированные, деленные насумму клинически истинно положительно классифицированных и клиническиложноотрицательно классифицированных.2.2.8. Оценка жизнеспособности и пролиферативной активностилимфоцитовКоличество клеток в суспензии определяли с использованием автоматического анализатора жизнеспособности клеток TC10 (BioRad, Сингапур). Как правило, одновременно определяли жизнеспособность клеток методом исключениякрасителя (трипановый синий) (Trypan Blue Dye 0,1%, Bio-Rad, Великобритания). Для определения количества живых клеток аликвоту суспензии (~20 мкл)смешивают с равным количеством 0,4% (w/v) раствора красителя в ФСБ. Живыеклетки не проницаемы для красителей, а мертвые клетки проницаемы и окрашиваются.
Пролиферативную активность и жизнеспособность культивируемыхклеток оценивали каждые 72 ч в течение 14 дней. Результат получали как процент мертвых клеток. Количество клеток в 1 мл суспензии пересчитывали на общий объем культуральной среды. Также пролиферативную активность клеток95оценивали с использованием автоматической сканирующей системы микроскопирования в режиме реального времени IncuСyte Zoom (Essen BioScience, CША)в течении 14 часов. Оценку кинетики роста клеточной популяции и функциональной активности клеток, культивируемых в 24-луночных планшетах проводили в том же анализаторе на протяжении 65 ч в условиях СО2 инкубатора. Каждый час автоматически получали изображение областей наблюдения и количественные характеристики заданных параметров клеточной популяции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
