Диссертация (1139554), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Поэтому актуален поиск эффективных способов активации invitro и повышения противоопухолевой активности NK-клеток.1.10. Оценка активационных способностей цитотоксическихлимфоцитовПосле активации ЦЛ приобретают ряд свойств, которые можно оценитьв условиях современной лаборатории. Морфологически лимфоциты увеличиваются в размерах и становятся более гранулярными.
Активированные NKклетки могут менять свою форму и приобретать адгезивные свойства [8]. Наповерхности эффекторных клеток увеличивается экспрессия маркеров активации, которые могут появляться в первые часы после активирующих воздействий и сохраняться несколько дней. Также увеличивается синтез различныхцитокинов и хемокинов, которые можно обнаружить в культуральной среде.Изменение эффекторных функций лимфоцитов можно определить по увеличению цитотоксической активности NK-клеток в тестах in vitro.Проточная цитометрия является мощным инструментом системного мультипараметрического анализа клеточных популяций и продуктивно используетсяв клеточной биологии, иммунологии и медицинской диагностике.
Цитофлуориметры позволяют исследовать тысячи клеток в секунду и дают достоверную информацию о морфологии клеток, их поверхностных антигенах, активности внутриклеточных ферментов, содержании ДНК и т.д. Большой выбор предлагаемыхмоноклональных антител, меченных различными флуорохромами, позволяет подобрать такое их сочетание, чтобы в одном исследовании получить максимальную информацию сразу о нескольких поверхностных антигенах, что дает возможность в одной пробе определить субпопуляционный состав исследуемого образца и судить о наличии или отсутствии различных патологий [1].63В практике лабораторий, осуществляющих фенотипирование лимфоцитов, наиболее широко распространена оценка субпопуляций эффекторныхклеток, соответствующих фенотипу CD4+ и CD8+ Т-клеток, NK- и NKT-клеток,иногда определяют экспрессию молекул HLA-DR на Т-клетках [79, 81].
Очевидно, что этих показателей недостаточно для комплексной оценки противоопухолевого звена иммунитета. Несмотря на активное исследование особенностей клеточного иммунитета при онкологических заболеваниях, многие детали пока остаются недостаточно изученными, что и диктует необходимостьдальнейшего изучения этой проблемы.При определении функциональной активности лимфоцитов особенно привоздействии иммунотропных лекарственных средств (ХТ, ИТ) целесообразнооценивать экспрессию поверхностных маркеров активации на лимфоцитах. Дляэтой цели можно изучать маркеры ранней (CD38, СD69) и более поздней (CD25,HLA-DR) активации лимфоцитов [9, 56].
Исследователи уделяют большое внимание экспрессии CD38 на поверхности NK-клеток. Молекула CD38 – это мембранный гликопротеин, представляющий собой фермент, регулирующий концентрацию цитоплазматического кальция, который обладает АДФ-циклазной иНАД-гидролазной активностью. Данная молекула также играет роль рецептора,модулируя межклеточные взаимодействия, и является переносчиком трансмембранных сигналов. Молекула CD38 экспрессируется на активированных Т-, В-,NK-клетках и некоторых других типах клеток. Есть данные о том, что обработкаCD38+NK-клеток антителами против CD38 приводит к активации их литическойспособности. Однако это происходило только в тех случаях, когда было возможновзаимодействие CD38 со специализированными сигнальными молекулами.
Вслучае NK-клеток роль такой молекулы играет CD16. Клетки с высоким уровнемэкспрессии CD38 проявляют низкую пролиферативную активность, но обладаютвысоким потенциалом в отношении продукции IL-2 и IFN-γ [362]. МолекулаCD38 представлена также на поверхности клеток в период их пролиферации идифференцировки.64Рецептор CD69 не экспрессируется на покоящихся лимфоцитах периферической крови, но появляется после активации лимфоцитов в течение 1-2 часов после антигенной стимуляции и имеет прямое отношение к активации генов, ответственных за синтез IL-2 [338, 343]. Выявлено, что Т-клетки с высокой экспрессиеймолекулы CD69 способствуют опухолевой прогрессии. Сигналы, поступающие срецептора активированных лимфоцитов, вызывают увеличение продукции IL-2 иэкспрессию рецепторов к нему на иммунокомпетентных CD25+ клетках [140].Молекула CD25 представляет собой α-цепь рецептора IL-2, которая появляется только при активации клетки и экспрессируется на CD4+, CD8+, NK-,NKT-, В-клетках и моноцитах.
CD25+ лимфоциты в норме могут составлять до18% от общей популяции лимфоцитов [81, 140].Повышение экспрессии HLA-DR на клеточной мембране является однимиз маркеров поздней и длительной активации клеток [9]. Происходит это в ответна выработку цитокинов активированными иммунокомпетентными клетками.Одним из поверхностных маркеров активированных NK-клеток являетсятрансмембранный гликопротеин или естественный рецептор цитотоксичностиNKG2D (CD314), который принадлежит к лектино-подобным рецепторам и необходим для проведения сигнала внутрь клетки и повышения функциональнойактивности киллеров [5].
Помимо NK-клеток, рецептор NKG2D определяется нанекоторых γδТ-лимфоцитах и является костимулирующей молекулой для CD8позитивных Т-лимфоцитов.Для оценки этапов дифференцировки лимфоцитов часто определяют поверхностный маркер CD45+RA, который экспрессируется незрелыми Т-клеткамии CD45+RO и относится к Т-клеткам памяти [283].Однако, на сегодняшний день не известны точные механизмы активациии супрессии противоопухолевого иммунного ответа. Поэтому изучение закономерностей функционирования субпопуляций лимфоцитов, механизмов ихактивации и фенотипических маркеров позволит дополнить наше представление о роли иммунной системы в канцерогенезе. Таким образом, для наиболееполной характеристики клеточного звена противоопухолевого иммунитета65необходимо определять не только субпопуляции эффекторных и супрессорных лимфоцитов, а также оценивать их активационную способность по поверхностной экспрессии соответствующих CD-маркеров.Обоснованность комплексного подхода к диагностике и динамическомунаблюдению при иммунотропной терапии диктует тот факт, что большинствопараметров иммунограммы, которые обычно определяются у больных злокачественными новообразованиями, не имеют непосредственного отношения к развитию и прогнозу онкологического заболевания.
Только некоторые элементы системы иммунитета на современном уровне знаний могут быть охарактеризованыкак противоопухолевые, и, в первую очередь, это клеточные механизмы.В связи с получением большого количества фактического материала и развитием различных направлений современной иммунологии становится очевидной необходимость при фенотипировании NK-клеток выявлять как общее количество, так и содержание отдельных их субпопуляций и определять их функциональную активность. Последнее время были предложены новые методологические подходы для определения функциональной активности NK-клеток, включая методы двойной люминесценции живых и мертвых клеток [289] с помощью проточного цитофлуориметра [298].Zimmermann S.Y. с соавторами классифицировали цитотоксические тесты, описанные в литературе на следующие категории: (1) Выявление умерших клеток-мишеней по высвобождению субстрата или с помощью визуализации клеток; (2) Обнаружение выживших клеток-мишеней поглотивших/удержавших вещества; (3) Определение эффекторной активности клетокпо высвобождению веществ или с помощью визуализации клеток [396].Одним из распространенных методов определения активности NK-клетокявляется клеточно-опосредованная цитотоксичность с использованием флуоресцентных красителей кальцеина АМ (САМ) и этидиума гомодимера-1 (Ethd-1).САМ окрашивает живые клетки, Ethd-1 проникая в ядро, окрашивает мертвыеклетки [292].
После постановки цитотоксического теста и инкубации клеток-эффекторов с мишенями проводят цитофлуориметрию. Живые клетки-мишени66флуоресциируют в зеленой области спектра, мертвые эффекторы – в красной области, а мертвые клетки-мишени одновременно в зеленой и красной областяхспектра. Литическую активность NK-клеток против клеток-мишеней обычнооценивают в различных соотношениях. Данный тест является хорошо воспроизводимым при наличии клеток-мишеней с жизнеспособностью более 95%.Оценить апоптоз в клетках-мишенях, который индуцируют NK-клеткичерез запуск внутриклеточных каспаз, можно цитофлуориметрически по активации каспазы-6 в клетках-мишенях [238, 291].В дополнение к цитотоксической функции NK-клетки способны секретировать значительные количества хемокинов и цитокинов, что ставит этиклетки в ряд важных регуляторов как врожденного, так и адаптивного иммунитета [5, 397].
За счет продукции цитокинов NK-клетки влияют на клеточныезвенья врожденного иммунитета и регулируют последующий антиген-специфический ответ. Так IFN-γ и TNF-α принадлежат к семействам цитокинов, обладающим множественными биологическими функциями [71]. Продемонстрирована эффективность этих цитокинов в терапии больных с различными злокачественными новообразованиями [26].
Изучение роли цитокинов в лечении злокачественных опухолей является одним из современных направлений развития онкологии. В результате иммунологических исследований получены сведения обиологических эффектах интерферонов, IL-2, TNF и др. Показана их роль в противоопухолевом лечении [46]. При этом наиболее важной задачей остается разработка рациональных режимов применения цитокинов в клинической практике.Определение содержания TNF-α в культуральной среде и сыворотке крови имеетдиагностическое значение в плане понимания процессов, происходящих как приактивации лимфоцитов, так и в организме человека при онкологических заболеваниях. Препараты на основе IFN-γ и TNF-α привлекают внимание в отношениивозможностей повышения эффективности противоопухолевого лечения, однаконеобоснованное применение цитокинов и использование их препаратов в высо-67ких дозах может привести к ряду негативных эффектов терапии.
Поэтому необходимо знать исходный уровень данных цитокинов у пациентов до начала лечения, а также возможность их влияния на лимфоциты in vitro.В заключении необходимо отметить тот факт, что NK-клетки играютважную роль как во врожденном, так и в адаптивном иммунном ответе, их количество и функция могут меняться при различных патологических состояниях, в частности, при онкологических заболеваниях. Хорошо известно, вопервых, ведущее значение NK-клеток и их цитотоксической функции при опухолевых и вирусных процессах [111]. Во-вторых, наличие регуляторной функции у отдельных субпопуляций NK-клеток ставит вопрос об их клиническом ипатогенетическом значении.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
