Диссертация (1139554), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Оценка общего состояния онкологического больногоНемаловажное значение в оценке эффективности лечения имеет опреде-ление общего состояния онкологического больного до и после проведения терапии. Для этого использовали шкалу ECOG (ВОЗ) (Eastern CooperativeOncology Group) (0-4 бала), которые представлены в таблице 8.81Таблица 8Общее состояние больного по шкале ECOG (ВОЗ)ECOGПолностью активен, способен выполнять все, как и до заболевания.Не способен выполнять тяжелую работу, но может выполнятьлегкую или сидячую работу.Способен к самообслуживанию, но не может выполнять работу.
Более 50% времени бодрствования проводит активно – ввертикальном положении.Способен лишь к ограниченному самообслуживанию, проводит в кресле или постели более 50% времени бодрствования.Инвалид, совершенно не способен к самообслуживанию, прикован к креслу или постели.Балл012342.2. Методы исследования2.2.1. Выделение мононуклеарных клеток из периферической кровиДля выделения популяции МНК использовали периферическую кровь,полученную в результате пункции локтевой вены взрослых доноров или онкологических больных, проходящих обследование или лечение в Центре. Кровьнабирали в пробирку типа вакутейнер с гепарином натрия и разводили в 2 разаФСБ, не содержащим CaCl2 и MgCl2 (Gibco by life technologies, Великобритания) и наслаивали на градиент (Histopague-1077, Sigma-Aldrich, Великобритания) с плотностью 1,077 г/мл в пропорции 1:3. Содержимое пробирки центрифугировали при температуре 18 оС в течение 20 минут 2200 об/мин.
В результате этого эритроциты и гранулоциты оседали на дно, а на границе раздела фазнаходились МНК. Отбирали прозрачный слой среды, расположенный непосредственно над опалесцирующим слоем МНК. Затем по всей площади сечения пробирки собирали клетки из интерфазы и переносили в чистую центрифужную пробирку. Разбавляли взвесь не менее чем 4-кратным избыткомсреды или ФСБ, тщательно перемешивали и центрифугировали один раз 15мин при 1500 об/мин и два раза по 10 мин при 1000 об/мин, после чего подсчитывали количество клеток в камере Горяева и переводили их в ППС.Клетки разбавляли ППС для культивирования лимфоцитов с концентрацией821-2 млн. клеток в 1 мл среды и культивировали в 24-луночном планшете илипластиковом флаконе на 25 мл (Corning, США).2.2.2.
Фенотипирование мононуклеаров периферической кровиДля оценки субпопуляционного состава лимфоцитов и маркеров активации пациентам проводилось фенотипирование лимфоцитов. Забор 5 мл периферической крови проводился в процедурном кабинете из локтевой вены в вакутейнеры с К3-ЭДТА или гепарином натрия в утренние часы натощак. Фенотипирование лимфоцитов проводили, используя цельную кровь или после выделения МНК как было описано.При окрашивании лимфоцитов периферической крови использовали антитела против антигенных детерминант лимфоцитов или кластеров дифференцировки (CD).
Для оценки чистоты выделения лимфоцитов всем больным проводили цитофлуориметрический анализ с использованием антител анти CD45(лимфоциты) и CD14 (моноциты). Также оценивали субпопуляционный составлимфоцитов (Т-, B-лимфоциты, Treg, NKT- и NK-клетки) периферическойкрови и маркеры активации (HLA-DR, CD38, CD69, NKG2D, CD25, CD95).Фенотип лимфоцитов также оценивали на этапах культивированияМНК на 3, 6, 10 и 14 день после начала активации в среде с IL-2 и c двумяцитокинами IL-2 и IL-15. Также проводили динамическое наблюдение за изменением фенотипа В-, Т-, Тreg, NKT-, NK-лимфоцитов периферическойкрови и маркеров активации у пациентов, включенных в исследование до АИТи на этапах наблюдения, примерно через 1 месяц, 3, 6 и 12 месяцев после неё.Использовали антитела, конъюгированные с флуоресцентными красителями РЕ, FITC, Alexa Fluor488 или PE-Cy5.5, которые связываются с антигенами клеточной поверхности, и соответствующий изотипический контроль.Применяли антитела к антигенам дендритных клеток CD11c, CD80, CD86, антигенам CD16 и CD56 (маркеры NK-клеток человека), к антигену CD3 (маркерТ-лимфоцитов), к антигену CD8 (маркер цитотоксических Т-лимфоцитов), кCD4 (маркер Тh лимфоцитов), к CD4+CD25bright (Treg), к CD19 (маркер В-лимфоцитов) и к маркерам активированных лимфоцитов: HLA-DR, CD25, CD38,83CD69, CD95 (все Beckman Coulter, Франция) и CD314 (eBioScience, США) и антигенам дифференцировки CD45+RO и CD45+RA (все Beckman Coulter, Франция).ЭкспрессиюNKG2D(CD314)анализировалинаповерхностиCD56+лимфоцитов с помощью двух- и трехпараметрического цитометрического анализа.Антитела добавляли к цельной крови, в концентрации согласно инструкциям производителей, и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре.
Далее разрушали эритроциты, с помощью лизирующего раствора (BD,США), инкубировали при комнатной температуре 10 мин и отмывали клеткицентрифугированием в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (Gibco by lifetechnologies, Великобритания) при 1500 об/мин в течение 5 мин и ресуспендировали клеточный осадок в 100 мкл 1,5% параформа в ФСБ.Иммунофлуоресцентное окрашивание суспензии лимфоцитов после выделения в концентрации 106 кл/мл проводили в 200 мкл ФСБ, содержащем 1% ЭТСв течение 30 мин при 40С. После этого проводили двукратную отмывку в ФСБцентрифугированием, разводили клеточный осадок в ФСБ в конечном объёме100 мкл и ресуспендировали. Затем проводили цитофлуориметрический анализ.2.2.3.
Проточная цитофлуориметрияАнализ флуоресценции и подсчет клеток (не менее 5000 событий в секторе живых клеток-мишеней в экспериментах по цитотоксичности и не менее10000 событий в экспериментах по анализу экспрессии поверхностных маркеров в гейте (области) лимфоцитов проводили на лазерном проточном цитофлуориметре FACScan (Becton Dickinson, США) или Cytomics FC 500 (BecmanCoulter, США). Интенсивность флуоресценции клеток наблюдали при длиневолны возбуждения 488 нм и регистрации 525 нм для FITC и 530 нм для AlexaFluor488, 580 нм для PE и 680 нм для PE-Cy5.5. Для исключения из зоны анализачастиц, не соответствующих по размерам и гранулярности живым клеткам вводили логические ограничения в гистограммы распределения частиц по малоугловому и 90-градусному светорассеянию. Результаты подвергали математической обработке с использованием программы MultiGraph и IMMUNO 4 (Coulter84Electronics Inc., Великобритания) или с помощью программы “CellQuest”(Becton Dickinson, США) или CXP Analysis 2.2 (Beckman Coulter, США).2.2.4.
Методы культивирования клетокВсе манипуляции с культурой клеток проводили с соблюдением требований стерильности. Данные требования выполнялись при пользовании ламинарным боксом биологической безопасности класс II тип A (SafeFAST Elite,FASTER, Италия), предназначенного для работы с патогенными агентами, смикроорганизмами III-IV групп патогенности согласно СП 1.3.2322-08, СП1.3.2518-09, при производстве готовых стерильных лекарственных средств.Методы культивирования клеток линии К562В качестве клеток-мишеней использовали клетки миелолейкоза человека линии К562 (не несущие на своей поверхности молекулы МНС первогокласса).
Клетки культивировали в суспензионной культуре в 24-х луночномпланшете (Costar, Великобритания) во влажной атмосфере с 5% СО2 при температуре 37оС в объеме 1 мл (105 кл/мл) в ППС с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Hyclone, США), инактивированной нагреванием на водяной бане до 560С на протяжении 45 мин. Состав ППС: RPMI-1640,40 мкг/мл гентамицина, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина и 0,05 мМ2-меркаптоэтанола (все Sigma-Aldrich, США).Криоконсервация и размораживание клетокКлетки К562 или лимфоциты замораживались в криопробирках (Costar,США) в концентрации 1 млн/мл в конечном объеме 1-2 мл со специальнойсредой для криоконсервации клеток (Bambanker, Lymphotec Inc, Япония) илив среде RPMI-1640, содержащей 10% ДМСО и 40% ЭТС. Для этого к осадкуклеток по каплям добавляли криосреду и перемешивали.
Ампулы плотно закручивали, подписывали и оставляли в морозильнике при температуре -30оСна 30 минут. После этого криопробирки перекладывали в оптимальные условия для хранения морозильной камеры (-135оС) или жидкого азота (-196оС).Размораживание клеток проводили быстро при температуре +37оС с использованием водяной термостатируемой бани, в которую помещали ампулу с85замороженной культурой клеток. Контроль оттаивания проводили визуально поисчезновению ледяного включения в ампуле, после наступления которого следует переходить к процедуре подготовки клеток к высеву с использованиемпроцесса центрифугирования с ускорением 200-250g в течение 5 мин в 10-кратном объёме ФСБ.
Далее отбирали среду от осадка, клетки ресуспендировали всреде для культивирования, проводили анализ количества клеток и их жизнеспособности для последующего засева и выращивания.Подготовка и культивирование клеток линии CHO/hsMICA-3DПодготовка штамма-продуцента проводили из замороженной культурыклеток линии CHO/hsMICA-3D в количестве 2 млн клеток с минимально допустимой жизнеспособностью 70%. Свойства клеток продуцента MICA позволяют проводить их культивацию как в прикрепленном, так и в суспензионномрежиме. Для культивирования использовали среду с химически определеннымсоставом и с нулевым содержанием белков животного происхождения CDOPTICHO.
Данная среда предназначена для выращивания клеток в суспензионной культуре.Наращивание культуры клеток проводили в колбах номинального объема 125 мл, в небольшом объеме (30 мл) с оптимальными характеристикамипо плотности засева. Культивирование проводили при использовании воздушного орбитального шейкера при частоте вращения 130 об/мин, помещенного вСО2-инкубатор, за счет чего обеспечивается контроль температурного режима(37оС) и содержания СО2 с заданным значением (7,5%). Контроль количестваклеток в мл и их жизнеспособность проводили ежедневно, совмещая с процедурой смены среды.При замене среды для отделения клеток от культуральной среды использовали процесс центрифугирования, 2000 об/мин 5 мин. Супернатант собирали,клеточную массу ресуспендировали в среде для культивирования и возвращалив емкость для культивирования. При достижении плотности клеток 1 млн клеток/мл посевной материал после центрифугирования переносили в емкости большего объема.
Перенос клеток осуществляют вместе со сменой среды.86Масштабное культивирование клеток-продуцентов проводили в колбахемкостью 1 л, при стартовом объеме культуральной среды 100 мл, посевнаяплотность клеток 100 000 клеток/мл среды. При завершении процесса подготовки посевного стока объем среды доводили до 300 мл, концентрацию клетокне менее чем 200 000 клеток/мл. Культивирование проводили в объеме 0,5 л сперемешиванием с приводом от магнитной мешалки.Культивирование клеток-продуцентов в большом объеме обеспечиваетнаработку среды в объеме 4-5 л за один производственный цикл. Цикличностьпроцесса 7 дней, режим смены среды в объеме 70% (ежедневно) – 50% (раз в2 дня) позволяет получить культуральную среду, содержащую MICA в объеме16 л, что соответствует необходимым требованиям. Содержание целевогобелка в культуральной среде было не менее 5 мг/л.Смену среды при культивировании клеток в больших объемах проводили путем пассивного осаждения клеток непосредственно в емкости под действием силы тяжести в отсутствие перемешивания, с последующим отборомбесклеточного супернатанта из емкости.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
