Диссертация (1139554), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Полученные данные обрабатывали с помощью программы IncuCyte Software и получалиграфики зависимости конфлюентности (отношение количества клеток к свободной площади поверхности пластика) лимфоцитов от времени наблюдения.2.2.9. Оценка цитотоксической активности лимфоцитовДля постановки цитотоксического теста были использованы стандартные для естественных киллеров клетки-мишени линии К562. В качестве эффекторов использовали МНК человека без прилипающих клеток и В-лимфоцитов, ЛАК- (ЦИК-) клетки на 3 день активации in vitro или NK-клетки.Цитолитическую активность NK-клеток оценивали цитофлуориметрически, используя специальный кит, содержащий два вида красителей для живыхи мертвых клеток-мишеней (L-3224) “Live/Dead” (Molecular Probes, США).Кальцеин АМ (САМ) окрашивает живые клетки, этидием гомодимером-1 (Ethd1) проникая в ядро, окрашивает мертвые клетки [292].
Была проведена оценкацитотоксического индекса активности лимфоцитов. Литическую активностьNK-клеток против клеток-мишеней оценивали в различных соотношениях. Исходя из количества мишеней (К562) – 15 тыс. клеток на образец, смешивали сэффекторами (МНК) в различных соотношениях (1:5, 1:10, 1:20, 1:40) или с NKклетками в соотношении 1:2 и 1:4.Оценка цитотоксической активности активированных лимфоцитов, культивируемых в среде с добавлением IL-2 ( 250 МЕ/мл) и IL-15 (50 нг/мл) на 0, 1,3, 5 и 7 день культивирования осуществлялась с использованием автоматической сканирующей системы микроскопирования в режиме реального времениIncuСyte Zoom (Essen BioScience, CША).
Смесь клеток-мишеней и эффекторов96в различных соотношениях культивировали в ППС с Ethd-1 в концентрации 2мкМ/мл. Каждые 30 мин производили автоматическое измерение уровня флуоресценции Ethd-1 при длине волны 528/617 нм в опытных лунках. Полученные данные обрабатывали с помощью программы IncuCyte Software.Клеточно-опосредованная цитотоксичность с использованием флуоресцентных красителей и проточной цитометрииРеакцию цитотоксичности проводили в ППС с 2% ЭТС в конечном объеме 400 мкл при 37оС в атмосфере с 5% СО2, инкубируя клетки-мишени иклетки-эффекторы в определенных соотношениях в течение 2-х часов. В опытные лунки вносили такие количества клеток, чтобы достигались соотношенияэффектор:мишень 40:1, 20:1 и 10:1, из расчета на 70 тыс.
мишеней [70]. Дляоценки жизнеспособности клетки-мишени предварительно окрашивали САМ.Для этого в клеточную суспензию (106 кл/мл) вносили САМ в конечной концентрации 40 нМ и инкубировали при комнатной температуре в течение 15мин с последующей отмывкой в PBS.
Для выявления мертвых клеток послепроведения цитотоксического теста клетки (эффекторы и мишени) обрабатывали красителем Ethd-1 в конечной концентрации 100 нМ и инкубировали втечение 15 мин при комнатной температуре. В дальнейшем экспериментальные образцы подвергали цитофлуориметрическому анализу. Живые клеткимишени флуоресциировали в зеленой области спектра, мертвые эффекторы в красной области, а мертвые клетки-мишени светились одновременно в зеленой и красной областях спектра. Последние были дискриминированы в отдельном квадрате с заданными границами.Оценка апоптоза клеток-мишеней, индуцированная NK-клетками череззапуск внутриклеточных каспазДля цитофлуориметрической оценки цитолитической функции NKклеток по активации каспазы-6 в клетках-мишенях использовали набор“CyToxiLux” (OncoImmunin, США) [291].97Клетки-мишени линии К562 (2х106 кл/мл) были предварительно окрашеныкрасителем TFL2 в течение 30 мин, однократно отмыты в буфере и ресуспендированы до конечной концентрации 1х106 кл/мл.
После этого клетки-мишени инкубировали с очищенной магнитной сепарацией популяцией NK-клеток или склетками NK92 в различных соотношениях в течение 60 мин при 37оС в атмосфере с 5% CO2. Затем клеточную смесь смешивали с раствором флуоресцентномеченого субстрата для каспазы-6 на 45 мин при 37оС с последующей отмывкой[238]. Анализ активности каспазы-6 проводили с помощью проточного цитометра при длине волны 488 нм, при этом оценивали долю клеток-мишеней с активированной каспазой-6 среди TFL-2-позитивных клеток.
Флуоресценция субстрата для каспазы-6 была измерена через канал FL1 (фильтр 530/30 нм), а окрашенные TFL2 клетки-мишени через канал FL2 (фильтр 575/26 нм) [1].2.2.10. Выделение NK-клеток методом магнитной сепарацииNК-клетки из нативных или активированных МНК отделяли методом магнитной сепарации с помощью набора Dynabeads Untouched Human NK cells(Invitrogen, Норвегия), по инструкции. Связывание лимфоцитов с антителами имагнитными частицами проводили в 15 мл пластиковой пробирке. Для этого всуспензию лимфоцитов в концентрации 100 млн/мл в 500 мкл буфера (ФСБ с 2%ЭТС) добавляли дополнительно 100 мкл ЭТС и 100 мкл смеси биотинилированных антител к Т- (анти CD3) и В-клеткам (анти CD19). Все хорошо перемешивалии инкубировали в течение 20 мин при +5оС с последующей отмывкой в 10 мл буфера центрифугированием при 350 g в течение 8 мин.
Удаляли надосадочнуюжидкость, а клетки разводили в 500 мл буфера и перемешивали. Затем добавляли500 мкл магнитных частичек, перемешивали пипетированием и инкубировали втечение 15 мин при комнатной температуре периодически помешивая. Послеэтого 10 раз перемешивали смесь и добавляли 5 мл буфера. Затем, с помощьюмагнита в течение 2 минут и принципа негативной селекции отделяли меченые Ти В-клетки, а оставшиеся в суспензии NK-клетки повторно переносили в пластиковую 15 мл центрифужную пробирку и отмывали ФСБ.
Далее производили98оценку чистоты выделения NK-клеток с помощью проточного цитометра и антител к CD3 и CD16/CD56.2.2.11. Получение, очистка и определение физико-химическихсвойств рекомбинантного белка MICAПолучение рекомбинантного белка MICA (rhMICA) проводили совместнос ЗАО «Протеинсинтез». Для этого культивирование клеток-продуцентов осуществляли в 5-ти емкостях, за один цикл собирали 1,5 л культуральной среды.Нанесение 3-3,5 л культуральной среды и очистку белка проводили в несколькоциклов.
Проведено 5 циклов очистки белка. С помощью программного обеспечения спектрофотометра NanoDrop 8000 (Thermo Scientific, США) определили оптические плотности растворов. В результате проведенных измерений была определена концентрация белка спектрофотометрическим методом.Выделение и иммуноаффинная очистка белка rhMICA избанкированной культуральной средыДля иммуноаффинной хроматографической очистки белка rhsMICA избанкированной культуральной среды необходимы буферы, состав которыхпредставлен в таблице 10.Таблица 10Необходимые растворы для хроматографической очистки белкаNaH2PO4NaClTween 20pHБуфер 120 мM100 мM0,1%7,5Буфер 220 мM1M0,1%7,5Буфер 3citric acid0,1 M0,1%2,2Буфер 4NaOH 2 M0Предварительно антитела anti-DED иммобилизовали на носителе Sepharose CL-4B (GE Healthcare, Швеция), сорбент хранили при температуре+5±2оС в законсервированном состоянии.
Колонку «набивали» 2 мл иммуносорбента и уравновешивали буферами 1 (примерно 10 объемов колонки) (таблица 10). Далее при температуре +5±2оС, в темноте со скоростью подачи среды2,0-2,5 мл/мин наносили размороженную культуральную среду и промываликолонку буфером 1 до выхода показаний самописца на базовую линию.99Для удаления неспецифической сорбции промывали колонку буфером 2 довыхода самописца на базовую линию. Удаляли остаток буфера 2, промывая колонку буфером 1 до выхода показаний самописца на базовую линию.
Элюировали,связанный искомый белок, буфером и отмывали остатки элюирующего буферараствором 1 до выхода показаний самописца на базовую линию. Элюат нейтрализовали буфером 4 до pH 7,0-7,5. Колонку промывали буфером 1 до выхода показаний рН на уровень 7,0-7,5 и законсервировали.
Хранили при температуре+5±2оС. Далее определяли концентрацию белка в элюате спектрофотометрическим методом при длине волны 280 нм и стерилизовали раствор белка фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм перед проведением электрофореза вполиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих и нативных условиях.Нанесение и очистку белка проводили в несколько циклов, единовременное нанесение составляло 3-3,5 л культуральной среды. Проведено 5 циклов очистки белка. Для определения оптической плотности белка готовилираствор испытуемого образца MICA с содержанием белка 0,2-2 мг/мл. С помощью программного обеспечения спектрофотометра определяли оптическиеплотности растворов (буфер 3 и раствор белка).
Вычисляли среднее арифметическое значение концентрации белка в образце по результатам 3 последовательных измерений при выбранной длине волны 280 нм.Определение стерильности белка MICAИсследование на стерильность проводили в соответствии с Государственной Фармакопеей РФ XII методом прямого посева. Стерильные пробирки вместимостью 20 мл промаркировали в количестве, достаточном для проведенияанализа, как минимум четыре пробирки: две – для тиогликолевой среды, две –для среды Сабуро. В пробирки помещали по 10 мл питательных сред. Затем добавляли по 1 мл исследуемого образца и слегка перемешивали (таблица 11). Пробирки помещали в термостат для инкубации: с тиогликолевой средой при температуре 32,5±2,5ºС в течение 14 суток; со средой Сабуро при температуре22,5±2,5ºС в течение 14 суток.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
