Диссертация (1139554), страница 18
Текст из файла (страница 18)
В результате культивирования клетокнарабатывается среда, содержащая целевой белок MICA, которая подлежитсбору, банкированию и фильтрации.Методы культивирования и активации лимфоцитовДля разработки метода активации лимфоцитов, изучения морфологическихособенностей лимфоцитов и изменения экспрессии поверхностных маркеров приактивации с различными цитокинами в различных концентрациях в исследованиипринимали участие 25 пациентов среди которых 10 больных меланомой кожи, 10больных злокачественными ОЖКТ и 5 больных почечно-клеточным раком(ПКР).
На 5 здоровых донорах отрабатывался метод активации лимфоцитов иоценка фенотипа, пролиферативной и цитотоксической активности лимфоцитови жизнеспособности. В качестве объекта исследования для оценки субпопуляционного состава лимфоцитов использовали периферические МНК, выделенные изкрови пациентов после получения письменного согласия перед началом лечения.87Периферические МНК выделяли из гепаринизированной крови на градиенте плотности Hystopague-1077 (Sigma-Aldrich, США) по общепринятой методике как описано выше [50].
После выделения проводили фенотипирование МНКс использованием антител анти CD45 и CD14. Также оценивали субпопуляционный состав лимфоцитов (Т-, B-, NK-, NKT-лимфоциты). Выделенные МНК помещали в 24-х луночный планшет (Costar, США) в концентрации 1-2 млн. в мл по 1мл в каждую лунку или в стерильные пластиковые флаконы (25 см3) по 10-15 млн.клеток. и на протяжении 14 дней культивировали в ППС RPMI1640 содержащей10% ЭТС или среде Х-vivo 20 (Lonza, США), содержащей человеческий рекомбинантный альбумин, с добавлением IL-2 в концентрациях 31,25; 62,5; 125; 250или 500 МЕ/мл (ронколейкин, Биотех, Россия) и с IL-15 (ImmunoTools, Германия)в концентрации 50 нг/мл или без него.
Культивирование проводилось в СО2 инкубаторе во влажной атмосфере при 37оС. Через каждые 48-72 часа половину питательной среды заменяли новой, собирали необходимое количество клеток дляизучения пролиферативной и цитотоксической активности, и бесклеточный продукт для определения содержания в нем цитокинов на 3 день культивирования.Выделенные МНК в необходимых концентрациях помещали на 65 часов в 24-луночные планшеты с той же питательной средой для изучения зависимости конфлюентности культивируемых клеток от концентрации IL-2 в среде.Морфологию клеток в культуре оценивали ежедневно при помощи инвертированного микроскопа Eclipse TS100 (Nikon, Япония).
Жизнеспособность клеток определяли с помощью 0,1% раствора трипанового синего на автоматическом счетчике клеток TC10 (Bio-Rad, Великобритания) при каждой замене среды.Производили визуальный анализ изменения формы, размеров, гранулярности иналичия адгезивных свойств у культивируемых лимфоцитов.Для подбора оптимальных условий активации, пролиферации и выживания лимфоцитов выделенные МНК помещали в стерильные пластиковые флаконы по 10 мл и культивировали на протяжение 14 дней в среде №1: RPMI1640 c глутамином (GlutaMAX-1), с добавлением гентамицина 10 мг/мл (Gibcoby life technologies, Великобритания), пирувата натрия (100 мM, 11 мкг/мл,88Sigma-Aldrich, Великобритания), IL-2 (ронколейкин, Биотех, Россия) (в различных концентрациях) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС)(Gibco by life technologies, Великобритания); или в среде №2: Х-vivo20 (Lonza,США) с добавлением гентамицина 10 мг/мл (все Gibco by life technologies, Великобритания), пирувата натрия (100 мM, 11 мкг/мл, Sigma-Аldrich, Великобритания), IL-2 (ронколейкин, Биотех, Россия) (250 МЕ/мл) и IL-15 (50 нг/мл)(ImmunoTools, Германия) в СО2 инкубаторе во влажной атмосфере при 37оС.Каждые 72 часа культивирования часть суспензионных клеток собирали дляфенотипирования, а 50% питательной среды заменяли новой.На 3, 5, 7, 9, 11 и 14 день культивирования собирали необходимое количество клеток для АИТ и оценивали их жизнеспособность с трипановым синим в процентах.
Для некоторых больных оставшиеся после культивированияклетки криоконсервировали и помещали в оптимальные условия для хранения(-196оС) до дальнейшего использования.2.2.5. Флуоресцентная микроскопияДля определения жизнеспособности и цитотоксической активности клетокв культуре проводили эксперимент по окраске живых и мертвых клеток с этидием гомодимером-1 – (Ethd-1) и кальцеином-АМ (САМ) (Molecular Probes,США). Конечная концентрация реагента Ethd-1 – 2 мкМ, CAM – 200 нМ.
Дляэтого готовили стоковый раствор реагентов в ФСБ и разводили первоначальныйраствор САМ (4 мМ) в 20 000 раз при анализе и Ethd-1 (2 мМ) в 1000 раз. Послеинкубации клеток с флуоресцентными красителями проводили анализ жизнеспособности или цитотоксической активности лимфоцитов с использованием прямого флуоресцентного микроскопа Ni-U (Nikon, Япония) или автоматическогоанализатора IncuCyte Zoom (Essen BioScience, CША).Если объём культуральных сред был различен, то готовили их по отдельности, внося необходимое количество Ethd-1 в соответствии с необходимымразведением. В ходе эксперимента выставляли такой порог чувствительностикрасного флуоресцентного сигнала, чтобы не детектировать фоновое (кон89трольное) значение сигнала от Ethd-1, которое получилось в самом начале эксперимента.
При запуске сканирования выбирали фазовый контраст и флуоресцентный каналы, базовый анализ (basic analyzer), частота сканирования – каждые 30 минут или 1 час. Наблюдали за клетками в приборе IncuCyte Zoom(Essen BioScience, CША) в течение 24-36 часов.Для цитотоксического теста к клеткам-мишеням К562, предварительноокрашенным САМ в течение 30 минут были добавлены лимфоциты в определенных соотношениях в 24-луночный планшет. Оценку цитотоксической активности АЦЛ, культивируемых в среде с добавлением IL-2 (250 МЕ/мл) и IL-15 (50нг/мл) осуществляли на 0 день и через 1, 3, 5 и 7 дней после активации.
Клеткиэффекторы и мишени смешивали в соотношениях 1:10, 1:20 и 1:40. По две лункина 1 экспериментальную точку. Исходная концентрация лимфоцитов 100 тысячна 1 мл среды. После смешивания лимфоцитов и клеток-мишеней линии К562 вовсе лунки добавляли Ethd-1. Смесь клеток-мишеней и эффекторов культивировали в ППС с Ethd-1. Планшет закрывали крышкой, ставили в IncuCyte Zoom собъективом 10Х и инкубировали на протяжении 4 часов при 37оС и 5% CO2 вовлажной атмосфере. Каждые 15 минут 9 изображений с каждой лунки были автоматически получены в режиме фазовоконтрастной и флуоресцентной микроскопии при длине волны испускания 494 нм и эмиссии 517 нм для зеленого цветаи при длине волны испускания 528 нм и эмиссии 617 нм для красного цвета. Анализ считался законченным, когда были проанализированы все заданные изображения.
Полученные данные обрабатывали с помощью программы IncuCyteSoftware (Essen BioScience, CША). Автоматически получали анализ пролиферативной активности (конфлюентности) клеток, цитотоксической активностиили жизнеспособности лимфоцитов и клеток-мишеней.2.2.6. Иммуноферментный анализСыворотку крови собирали из надосадка после центрифугирования пробирок с периферической кровью без антикоагулянта при 200 g в течение 15мин и переносили в микропробирки типа Eppendorf по 0,5-1,5 мл для замораживания и последующего хранения (-30оС).90Содержание белка sMICA в сыворотках крови определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора реагентов DuoSetELISA human MICA (R&D Systems, США). В лунки 96-луночного планшета(Immuno Maxi-Sorp, Nunc) наносили мышиные антитела к белку MICA (CaptureAntibody, 2 мкг/мл) и инкубировали в течение ночи, затем три раза промывалилунки ФСБ с pH 7,2 (PBS), содержащим 0,05% Tween 20.
Остатки буфера дляотмывки удаляли с помощью фильтровальной бумаги с простукиванием. Дляуменьшения неспецифического связывания в лунки вносили блокирующий буфер, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина и инкубировали 1 ч споследующей отмывкой. Далее в лунки наносили стандартные образцы рекомбинантного белка MICA известной концентрации и исследуемые образцы сыворотки крови больных и здоровых доноров, инкубировали в течение 2 ч и отмывали.
Затем в каждую лунку вносили биотинилированные козьи антитела к другому эпитопу белка MICA (Detection Antibody, 400 нг/мл), инкубировали в течение 2 ч, далее лунки промывали три раза. Затем добавляли в каждую лунку раствор конъюгата стрептавидина с пероксидазой из корней хрена (1:200) и инкубировали 20 мин в темноте с последующей отмывкой. Цветную ферментативнуюреакцию проводили в присутствии перекиси водорода и субстрата ТМБ (3, 3', 5,5'-тетраметилбензидин) в течение 5-20 мин, планшет держали в темноте. Затемостанавливали ферментативную реакцию, добавляя в каждую лунку 2N растворсерной кислоты. Измерение оптической плотности образцов проводили придлине волны 450 нм на планшетном фотометре Multiskan MCC/340 MK II Titertek(Flow Lab, США) или ChroMate 4300 (Awareness Technology, США).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
