Диссертация (1139554), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Более того, этопозволяет использовать активированные клетки после криоконсервации безприменения больших доз цитокинов для экспансии NK-клеток ex vivo [252].В настоящее время исследования в области противоопухолевой ИТ продолжаются, и число их неуклонно растет [32, 284, 301, 314]. Идет поиск высокотехнологичных и безопасных методов ИТ в онкологии [23]. Однако на сегодняшний день нет общепринятого метода выращивания ЦЛ. Поэтому актуален поискэффективных методов активации и повышения противоопухолевой активностилимфоцитов больных in vitro.Для повышения эффективности NK-клеточной терапии онкологическихбольных необходимо дальнейшее изучение биологии этих клеток и способових оптимальной активации.
Возможность влиять на активность NKT-клеток, атакже получение новых агентов, способных дифференцированно активировать различные функции NK-клеток, может не только помочь в разработке новых методов лечения и профилактики злокачественных новообразований, нои повысить эффективность существующих методов ИТ.Таким образом, проведенный анализ данных отечественной и зарубежной литературы свидетельствует об актуальности дальнейшей разработки ме-58тодологии и оптимизации применения АИТ на основе аутологичных или аллогенных ЦЛ и изучения клинической эффективности АИТ при лечении больных диссеминированными солидными опухолями.1.9. Методы получения активированных NK-клеток in vitroВ настоящее время в литературе нет единого мнения по поводу оптимального метода культивирования лимфоцитов и получения фракции активированных ЦЛ пригодных для АИТ.
Как известно, наибольший успех достигается при адоптивном переносе активированных IL-2 ЛАК-клеток, но высокиеи слишком низкие концентрации дают плохой клинический результат, причемможет возникнуть тяжелые токсические побочные эффекты при введении IL2 в больших концентрациях [27, 47, 278]. В ряде зарубежных публикаций впоследние годы обсуждается вопрос использования краткосрочно активированных цитотоксических лимфоцитов с высокими концентрациями цитокинов[151, 233, 314].
Так как на сегодняшний день нет стандартизованного методаактивации пула цитотоксических лимфоцитов, разработка протоколов культивирования лимфоцитов является актуальной научно-практической задачей.Для получения большого количества ЛАК-клеток чаще всего используют аферез и магнитную сепарацию. Далее кратковременно в течение 1-2 суток инкубируют NK-клетки в присутствии больших доз интерлейкинов и вводят внутривенно капельно пациенту [284]. Однако данные подходы имеют ряднедостатков. Применение лимфофереза у онкологических больных ограничивается длительной многочасовой процедурой и частой лимфопенией, котораянередко сопровождает химиотерапевтические воздействия.
Внутривенноевведение большого количества АЦЛ приводит к реакциям ТПХ и повреждению сосудов, за счет повышенной экспрессии ЛАК-клетками рецепторовтропных к эндотелию сосудов. Также такие процедуры могут приводить к развитию аутоиммунной патологии. Поэтому актуальна разработка безопасногометода АИТ.Цитотоксические NK-лимфоциты можно получить из МНК или изCD34+ гемопоэтических стволовых клеток, индуцированных плюрипотентных59клеток или из стволовых клеток пуповинной крови, однако это требует длительного периода культивирования – более 21 дня, что не всегда выполнимодля лечения больных высокого риска [233]. Некоторые группы исследователейдля терапии используют NK-клеточные линии (NK-92, NKL, KYHG-1, YT,NKG).
Их можно модифицировать генами различных цитокинов или химерными антигенными рецепторами (CAR). Однако сложно проследить их активность in vivo и распределение в организме, что требует дополнительных исследований. Разрешенным и соответствующим требованиям GMP методом получения чистой субпопуляции NK-клеток является аферез и редукции Т- и Влимфоцитов [233]. Этот подход тоже не лишён недостатков.
Сама процедуразанимает около 5 часов. В результате удаления Т- и В-лимфоцитов из циркуляции возможно развитие иммунодефицитных состояний и аутоиммунных заболеваний. Также у онкологических больных вследствие побочных токсических воздействий ХТ возможна миелосупрессия, которая проявляется лимфопенией и угнетением клеточного звена иммунитета.Одним из общепринятых методов увеличения активности ЦЛ (NKклеток и CTL) является культивирование МНК in vitro в сочетании с цитокинами, антителами, ростовыми факторами или фидерными клетками [76, 133,339].
Полагают, что ЛАК-клетки осуществляют свой эффект за счет одновременного взаимодействия сразу нескольких субпопуляций иммунокомпетентных клеток с различным фенотипом. ЛАК-клетки обычно получают из МНКпериферической крови здоровых доноров и онкологических больных после ихкультивирования in vitro в присутствии IL-2. Также IL-2 используют системнодля активации лимфоцитов ex vivo непосредственно в организме онкологического больного. Предполагали, что ЛАК-клетки приобретут способность убивать аутологичные опухолевые клетки [228].
Показана их эффективность в отношении широкого спектра аллогенных опухолевых клеток in vitro, таких какКРР, рак поджелудочной железы, гортани, почки и саркомы в то время какнормальные лимфоциты периферической крови не способны убивать опухолевые клетки [95, 105, 311]. Однако, клиническая эффективность применения60ЛАК-клеток совместно с IL-2 оказалась низкой [30, 228]. Да и введение больших доз IL-2 не лишено ряда побочных эффектов. Добавление клеточных линий, которые используют в качестве фидера, к NK-клеткам увеличивает пролиферативную активность лимфоцитов.
Однако некоторыми учеными былопоказано, что в этом случае происходит снижение экспрессии CD16 и уменьшается цитотоксическая активность эффекторных клеток [96].В нашей стране есть несколько патентов на выращивание цитотоксических лимфоцитов. Известен «Способ получения активированных лейкоцитовдля адъювантной АИТ злокачественных новообразований» по патенту RU2414915 [83]. В нём лейкоциты выделяют из периферической крови, культивируют в среде с добавлением Г-КСФ. При этом лейкоциты выделяют из стабилизированной гепарином периферической крови посредством смешиванияс полиглюкином течение 30 мин. Основным недостатком способа является добавление Г-КСФ, который регулирует пролиферацию и дифференцировку клеток гранулоцитарного ряда, а не лимфоцитов, также короткие сроки культивирования клеток, не позволяющие проводить АИТ в течение длительного периода времени без дополнительного забора крови.
Также есть «Способ лечениябольных раком легкого» по патенту RU 2500435 [89]. В нем предложено допроведения лечебной процедуры из крови больного произвести забор лимфоцитов методом лимфоцитафереза и приготовить лейкоцитарную массу. Затемпроизвести активацию ронколейкином 20 мл лейкоцитарной массы из расчетасоответственно 1000 МЕ на 1 мл путем инкубации в термостате с последующим двукратным центрифугированием. Главными недостатками способа являются использование высоких концентраций IL-2 в среде для культивирования клеток и сроках культивирования клеток, не позволяющих длительногопроводить АИТ.
Другой способ получения активированных МНК по патентуRU 2402338 описывает активацию in vitro в течение 18-48 ч концентрата лимфоцитов и макрофагов, выделенных из крови донора или пациента, которыйосуществляют комплексом, включающим фармакопейный препарат рекомби-61нантного IL-2 и β-циклодекстрин [48]. Все эти способы получения активированных лимфоцитов направлены на кратковременную инкубацию и периодический забор крови у пациентов, что усложняет процесс АИТ.Следующим подходом к активации противоопухолевой активности лимфоцитов стала клеточная терапия, которая осуществляется за счет ЦИК-клеток[341]. Она основана на стимулирующем эффекте нескольких факторов, таких какразличные цитокины и моноклональные антитела [341, 379].
По сравнению сЛАК-клетками ЦИК-клетки оказывали повышенную противоопухолевую активность у мышей [379]. Активность ЦИК-клеток in vitro может быть повышена путем стимуляции лимфоцитов цитокинами, такими как IL-2, IL-12, IL-15 или IL-18[47, 241]. Важную роль в противоопухолевой активности АЦЛ, таких как Т-лимфоциты и NК-клетки играют именно IL-2 и IL-15. Добавление данной комбинации цитокинов в ППС способствует повышению жизнеспособности, пролиферативной активности и функциональной противоопухолевой активности культивируемых лимфоцитов. Цитокины, находящиеся в супернатанте (культуральнойсреде), положительно влияют на поверхностную экспрессию маркеров активациилимфоцитов периферической крови. Эффективность ЦИК клеточной терапиибыла показана в последние годы.
Описан случай частичной регрессии метастазовв легкие при раке почки [256]. У пациента с прогрессирующей аденокарциномойподжелудочной железы удалось достичь увеличения безрецидивного периода более 19 месяцев после ЦИК-терапии [250]. Анализ базы данных клинических испытаний II/III фазы применения ЦИК-клеток обнаружил существенное увеличение полугодовой, годичной и двухлетней выживаемости, а также безрецидивнойвыживаемости и среднего времени до прогрессирования. Однако в данных исследованиях не было отмечено полного ответа на терапию [264]. Подобный анализрезультатов ЦИК-терапии 426 онкологических больных показал также уменьшение объема опухолевой массы у пациентов.Развитие данного направления представляет собой новую стратегию, которая может способствовать снижению риска метастазирования и рецидива62опухолевого роста [162, 185, 316]. Последние исследования и клинические испытания показали, что АИТ может быть эффективным методом лечения и способствовать улучшению результатов лечения онкологических больных.Несмотря на успехи в получении пула активированных лимфоцитов насегодняшний день нет универсального метода выращивания цитотоксическихлимфоцитов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
