Диссертация (1139554), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Посевы осматривали в рассеянном свете.100Таблица 11Схема пробоподготовки для определения стерильности экспериментальных образцов КОМБАС№ пробыТиогликолеваяСреда Сабуро,Исследуемыйсреда, млмлобразец, мл1, 21013, 4101Наличие роста микроорганизмов определяли визуально по появлениюмутности, осадка, хлопьев и других изменений раствора.
Если такие измененияпоявлялись, проводили микроскопическое исследование мазков, окрашенныхпо Грамму. Испытуемый препарат считали стерильным при отсутствии ростамикроорганизмов во всех образцах. В результате проведенного визуальногоисследования проб не было отмечено появление мутности, осадка, хлопьев идругих изменений. При наличии роста хотя бы в одной пробирке испытуемыйпрепарат оценивали на стерильность повторно или браковали.Определение электрофоретической чистотыДля определения чистоты, гомогенности и молекулярной массы генноинженерных продуктов применяли метод вертикального электрофореза вПАА геле с додецилсульфатом натрия (SDS) в редуцирующих и нередуцирующих условиях с последующей окраской геля как Кумасси ярко-голубым R250, так и нитратом серебра.Электрофорез проводили на двух гелях: один использовали для окраскиКумасси, другой для проведения иммуноблот анализа.
Использовали буферы:фосфатно-солевого буфер (PBS) рН=7,4: 150 мM NaCl, 10 мM NaH2PO4; буферЛэммли рН=6,8: 62,5 мM Трис-HCl, 2% SDS, 25% глицерол, 0,01% бромфенол;буфер для электрофореза рН=8,3: 25 мM Трис-HCl, 192 мM глицин, 0,1% SDS;буфер «для переноса» 25 мM Трис-HCl, 192 мM глицин; блокирующий буфер(TBST) рН=7,4: 500 мM NaCl, 20 мM Трис-HCl, 10% Tween 20,5% обезжиренногосухого молока (все Sigma-Aldrich, США).Разделение белков проводили в денатурирующих и неденатурирующихусловиях в 7,5% ДСН-ПААГ (толщина 0,75 мм) по Лэммли в камере для вер-101тикального электрофореза (Mini PROTEAN III, Bio Rad).
Для определения чистоты полученного белка электрофорез проводили с нагрузкой на лунку 10мкг. Электрофорез осуществляли в режиме постоянного тока, сила тока составляет 15 мА. В качестве стандартов молекулярных весов использовалиDual-Color Prestained Low-Range Protein Standarts (Bio-Rad, США).Окрашивание гелейГель фиксировали в 10% уксусной кислоте в течение 10-15 мин для гелей толщиной 0,7 мм и 30-60 мин для гелей толщиной 1,5 мм (пока остаткиполосы краски не пожелтеют).
Раствор сливали. Гель окрашивали в 10% уксусной кислоте, 45% этаноле, 0,125% Coomassie G-250 Brilliant Blue. Заливаликраску в коробку с гелем и ставили на качалку, примерно на 30 минут. Далеегель отмывали в 10% уксусной кислоте.2.2.12.
Иммуноблот-анализДля проведения иммуноблоттинга производили перенос на PVDF мембрану (HYBOND-P, Amersham). Для этого мембрану погружали в буфер «для переноса», гель вынимали из электрофорезной камеры и отделяли от стекол, послечего погружали в буфер «для переноса». Для осуществления переноса белков сгеля на мембрану использовали прибор для полусухого переноса белков с геляна мембрану (Hoefer SemiphorTM Pharmacia Biotech). При переносе белков укладывали «сэндвич», который состоит из мембраны 3ММ, мембраны PVDF, геля,мембраны 3ММ.
Перенос длился в течение 45 мин при 55 мА. Далее проводилидетекцию белков на мембране с помощью антител. Мембрану после переноса нанее белков на один час погружали в блокирующий буфер TBST. Затем мембрануинкубировали в течение одного часа при комнатной температуре в 1 мл антиDED антител, разведенных в блокирующем буфере в соотношении 1:100. Послеинкубации с первичными антителами мембрану промывали в трех сменах TBSTпо 5 минут.
Затем инкубировали с вторичными антителами овцы против иммуноглобулинов мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена и разведеннымив блокирующем буфере в соотношении 1:10000 в течение одного часа при комнатной температуре. Далее мембрану промывали трижды в TBST в течение 15102мин. и проявляли с использованием субстрата ECL plus, GE Healthcare (Великобритания).
Потом мембрану инкубировали в течение 5 минут с субстратом и излишки субстрата удаляли с мембраны с помощью фильтровальной бумаги. Детектировали люминесценцию мембраны с использованием системы ChemiDocXRS, Bio-Rad (США).2.2.13. Методика адоптивной иммунотерапииАдоптивная иммунотерапия АЦЛ проводилась после подписания информированного согласия пациента и в соответствии с протоколом клинического исследования, утвержденным на заседании этического комитета Центра.В исследование были включены 79 пациентов, характеристика которыхприведена ранее в пункте 2.1.Периферические МНК выделяли из 30 мл гепаринизированной крови больных, которую забирали перед операцией или перед (между) курсами ХТ или ЛТ.МНК выделяли на градиенте плотности и культивировали в бессывороточнойсреде с 250 МЕ/мл IL-2 и/или 50 нг/мл IL-15 на протяжении 10-14 дней в условиях СО2 инкубаторе при температуре 37оС и 5% СО2.
Для поддержания жизнеспособности АЦЛ каждые 2 дня меняли половину объема ПС на новую. Ежедневно проводили морфологическую оценку культуры лимфоцитов и визуальную оценку питательной среды на присутствие патогенной микрофлоры.Проведение АИТ начинали через 3 дня после начала активации лимфоцитов. АИТ включала в себя несколько введений АЦЛ на 3, 5, 7, 9, 11 и 14 денькультивирования. Для этого необходимое количество клеток собирали из культуральных флаконов, центрифугировали и разводили стерильным физиологическим раствором в объеме 1-2 мл, а оставшийся супернатант распределяли в ампулах объемом 1,5-2 мл и хранили при температуре -30 °С для дальнейшего использования. После введения всех активированных лимфоцитов лечение продолжалинаработанным клетками бесклеточным продуктом (супернатант) в объеме 1,5-2мл.
Активированные лимфоциты в количестве 5-30 млн. и бесклеточный продуктвводили внутрикожно паравертебрально в 2-6 точек на введение. На один курсколичество АЦЛ составляло от 30 до 100х106 клеток. Один курс АИТ включал103введение клеток и всего наработанного за 10-14 дней клеточного супернатанта напротяжении 1-3 месяцев 1-2 раза в неделю.
Далее курс АИТ повторяли и осуществляли очередной забор крови – второй курс АИТ. Каждому больному АИТпроводили по индивидуальной схеме, в зависимости от пролиферативной активности, активации и жизнеспособности лимфоцитов. Также учитывался территориальный компонент и удаленность проживания пациента. Курсы АИТ повторяли каждые 3 месяца в зависимости от особенностей течения заболевания, общелабораторных показателей и иммунного статуса пациента.Перед проведением АИТ и через 1, 3, 6 и 12 месяцев от начала лечения производили мониторинг показателей иммунитета и оценивали субпопуляционныйсостав (В-, Т-, NKT-, NK-клеток, Treg) и оценку поверхностной экспрессии маркеров активации лимфоцитов (HLA-DR, CD38, CD69, NKG2D, CD25, CD95).Для определения функциональной активности культивируемых клетокпроизводили оценку концентраций IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-α, IFN-γ и TNF-α вклеточном продукте на 3 день культивирования в присутствии различных концентраций IL-2 (0, 50, 125 и 250 МЕ/мл). ИФА проводили по инструкции с помощью набора реагентов фирмы Вектор Бест (Россия).
Оптическую плотность образцов измеряли на фотометре ChroMate (Awareness Technology, США).Оценка эффективности ИТ осуществлялась по критериям, основанным накритериях ВОЗ и общепринятых критериях RECIST 1.1 для оценки эффективности иммунотерапевтических воздействий irRC как было описано выше.2.3. Статистический анализ данныхСтатистический анализ данных проводили с помощью программ MicrosoftExcel 2003, Statsoft Statistica 8.0. (StatSoft, USA) и SPSS® Statistics Subscription(IBM, USA).
Данные представляли, как среднее по группе ± стандартное отклонение (SD). Обработку результатов проводили методами вариационной статистики с соответствующими расчетами среднего арифметического и стандартнойошибки среднего [66]. Статистический анализ различий данных, полученных вразных группах, проводили c использованием t-критерия Стьюдента и U критерия Манна-Уитни с использованием программного обеспечения SigmaPlot 11.0104(Systat Software Inc., США). Различия считали значимыми при р<0,05. Анализ параметров выживаемости выполняли по методу Каплана-Майера (Kaplan-Meier)применяли Log Rank (Mantel-Cox) тест и критерий хи-квадрат с оценкойуровня значимости по таблицам сопряженности. Результаты цитометрическихисследований подвергали математической обработке с использованием программы MultiGraph и IMMUNO 4 (Coulter Electronics Inc., Великобритания) илис помощью программы CellQuest (BD Biosciences, США) и WinMDI (Dr.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
