Диссертация (1139554), страница 28
Текст из файла (страница 28)
Анализ данных выполнялся автоматически по заданным параметрам спомощью программы IncuCyte Software. Оценивали конфлюентность, т.е. пролиферативную активность клеток, количество живых или мертвых клеток по включению флуоресцентных красителей в зависимости от времени культивирования.В данной работе представлены типичные графики роста клеточной популяциилимфоцитов в различных условиях при культивировании МНК. Первоначальнодля активации лимфоцитов мы использовали МНК донора и среды с различнойконцентрацией IL-2 (рис.
19).Было показано, что лимфоциты пролиферируют пропорционально увеличению концентрации цитокина. Отмечено, что в присутствии IL-2 в низких концентрациях пролиферация лимфоцитов в первые трое суток культивирования всреднем увеличивалась на 75±15%. Среди фракции адгезионных клеток этот показатель варьировал от 20 до 30% (рис. 19). Наибольшая пролиферативная активность в первые 36 часов культивирования наблюдается при максимальной концентрации интерлейкина, однако в данном случае была достоверно снижена жизнеспособность лимфоцитов до 85% во всех опытных образцах клеток (р<0,05),что не позволяло культивировать лимфоциты длительно.
Поэтому мы выбралиоптимальную концентрацию IL-2 в 250 МЕ/мл.140Рисунок 19. Пролиферативная активность лимфоцитов при добавлении IL-2 вразличных концентрациях.Для сравнения данных использовали среду для культивирования не содержащую IL-2. Показано, что в среде без интерлейкина пролиферативная активность лимфоцитов низкая (рис. 20).без IL-2IL-2 (250 МЕ/мл)14000количество клеток12000100008000600040002000001020304050время, часыРисунок 20. Влияние IL-2 на пролиферативную активность лимфоцитов донора.Так после активации в присутствии IL-2 (250 МЕ/мл) клетки начинают пролиферировать с первых часов культивирования и их количество увеличивается141до 9 раз уже через 15 часов после начала активации (рис. 20).
По сравнению снеактивированными лимфоцитами данный показатель был выше в 2,5 раза(р<0,05). Далее происходило незначительное нарастание пролиферативной активности лимфоцитов до 5-7 дня культивирования и сохранялось до 10 дня(рис. 21).Рисунок 21. Пролиферативная активность лимфоцитов в различные сроки послеактивации IL-2 (250 мкг/мл).Оценивая морфологию активированных лимфоцитов и их поведение вкультуре, было отмечено, что у всех пациентов со 2 дня культивирования с IL2 лимфоциты начинают изменять форму с круглой на продолговатую и неровную и увеличиваться в размерах (рис.
22). Также замечено, что данная морфология больших гранулярных лимфоцитов сохраняется на протяжении всего периода выращивания. Было показано, что при добавлении 125 МЕ/мл IL-2 меньшая часть лимфоцитов увеличивается в размерах, но размер их был гораздобольше, чем у лимфоцитов при добавлении 250 МЕ/мл (рис. 22 б, в). После 4872 ч культивирования некоторые лимфоциты прилипали к пластику и в процессе пролиферации формировали группы (рис. 22 г, д). Так же было отмечено,что у некоторых пациентов в данной среде лимфоциты начинают терять адгезионные свойства после 7-8 дня культивирования, что свидетельствует о завершении процесса активации (рис.
22 е).142абвгдеРисунок 22. Влияние IL-2 на морфологию лимфоцитов (ув. х400)а) морфология мононуклеарных клеток сразу после выделения;б) через 3 дня культивирования в среде с IL-2 (125 МЕ/мл);в, г) через 3 дня культивирования в среде с IL-2 (250 МЕ/мл);д, е) через 5 и 10 дней культивирования в среде с IL-2 (250 МЕ/мл).Для проверки принадлежности клеток с адгезивными свойствами к лимфоцитам сразу после выделения МНК было проведено иммунофенотипирование суспензии клеток, которое выявило наличие CD14+клеток, т.е.
моноцитовменее чем в 2% случаев. Известно, что адгезивными свойствами могут такжеобладать В-лимфоциты и в меньшей степени Т- и NK-клетки во время активации. В организме этот процесс происходит только в лимфоидных органах приактивации лимфоцитов.143Хорошо известно, что циркулирующие в крови лимфоциты являются полностью дифференцированными клетками, а пролиферативная активность у нихпоявляется только после стимуляции и в организме происходит в периферических органах иммунной системы. В условиях in vitro лимфоциты не пролиферируют без дополнительных стимулов, таких как цитокины, поэтому активно разрабатываются методы не только краткосрочной активации лимфоцитов in vitro,но и длительного наращивания их количества с сохранением жизнеспособностии нужных свойств.
Таким образом, в данной части работы было показано, чтоIL-2 в концентрации 250 Ед/мл является оптимальной составляющей средыдля культивирования МНК при сохранении высокой жизнеспособности и пролиферативной активности.4.1.2. Оценка секреторной функции лимфоцитов после активации in vitroв присутствии IL-2Для изучения функциональной активности АЦЛ был оценен цитокиновыйстатус больных меланомой и уровень IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, INF-α, IFN-γ и TNFα в культуральной среде на 3 день после активации МНК с различной концентрацией IL-2 (50, 125, 250 МЕ/мл).
У данных больных в сыворотке крови были обнаружены следовые количества IL-2, IL-10, IFN-α и TNF-α от 1 до 3 пг/мл, которые не отличались от контрольных значений. Результаты ИФА супернатантовпоказали, что концентрация большинства цитокинов в разной степени повышается пропорционально увеличению начальной концентрации IL-2 в питательнойсреде (рис. 23). Данное повышение концентрации цитокинов в супернатанте свидетельствует об увеличении цитокинопродуцирующей секреторной функцииМНК в процессе их активации. Показано, что на 3-й день культивирования МНКнаблюдалась максимальная продукция IL-2. Так содержание IL-2 в супернатантепри начальной концентрации в 250 пг/мл превысило максимальное значение в1000 пг/мл у 100% исследуемых бесклеточных продуктов (рис. 23).144концентрация цитокина(пг/мл)1200**1000IL-2IFN-800600**400200***7273125концентрация IL-2 (МЕ/мл)250050IL-6TNF-ɑIFN-ɑIL-4IL-10Рисунок 23.
Зависимость концентрации цитокинов в супернатанте на 3 день культивирования лимфоцитов от концентрации IL-2 в питательной среде.*достоверные различия содержания цитокина в зависимости от концентрации IL-2(p<0,05).Однако, содержание провоспалительного цитокина IFN-α и противовоспалительного цитокина IL-4 в культуральной среде практически не изменилось, чтовозможно связано с малым содержанием среди АЦЛ продуцентов данных цитокинов, к которым относятся Тh2 и клетки фагоцитарного ряда.
Также наблюдали увеличение выработки цитокинов IL-6 и IL-10. Так, при концентрации IL-2 в 125пг/мл содержание в среде IL-6 выросло в 1,5 раза, а IL-10 в 2,5 раза (p<0,05). Сдругой стороны наблюдали многократное увеличение провоспалительных и тумороцидных цитокинов IFN-γ и TNF-α. Отмечали повышение концентрации INF-γ в10 раз, а TNF-α в 6 раз и при увеличении концентрации IL-2 до 250 пг/мл она неизменилась (p<0,05), а содержание IFN-γ увеличилось в 14,8 раз, что можно связать с повышенной секреторной активностью CTL и NK-клеток, которые и могутиспользоваться для ИТ.
Интерферон-гамма также индуцирует и стимулирует продукцию лимфоцитами провоспалительных цитокинов (TNF, IL-6). Показано, чтоконцентрация IL-6 превысила максимальные значения в 300 пг/мл – у 87% образцов, а максимальное значение TNF-α в 250 пг/мл было выше у 47% образцов.Таким образом, в работе показано, что помимо оптимальных показателей пролиферативной активности и выживаемости клеток, концентрация IL-2в среде для культивации МНК в 250 Ед/л, дает и наибольшую секреторнуюактивностью.1454.1.3. Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов и экспрессии активирующих рецепторов после культивирования in vitroПри изучении процесса активации лимфоцитов часто оценивают экспрессию маркеров ранней (CD38, CD69, CD25) и поздней (HLA-DR) активации [56, 140, 338]. Кроме того NK-клетки несут на своей поверхности рецепторNKG2D, который необходим для проведения активирующего сигнала внутрьклетки и повышения цитотоксической активности киллеров [5].
Дополнительно, для оценки этапов дифференцировки лимфоцитов часто определяютповерхностный маркер CD45+RA, который экспрессируется незрелыми Тклетками и CD45+RO, который относится к Т-клеткам памяти [56].Для определения субпопуляционного состава лимфоцитов и маркеровактивации у больных, было проведено фенотипирование CD45+клеток периферической крови и суспензионных ЛАК-клеток у 20 больных с разными онкологическими заболеваниями (КРР и меланома) на 0, 3, 6, 10 и 14-й день культивирования. Метод проточной цитофлуориметрии и использование комбинации антител CD45+CD14+ показало, что лимфоциты составляют более 98% исследуемых клеток, а доля CD14+клеток, т.е.
моноцитов составляла менее 1%,остальные клетки представлены В-лимфоцитами (CD45+CD20+) – 5-11%, Тлимфоцитами (CD45+CD3+) – 62-74%, NK-клетками (CD3-CD16+CD56+) – 718% и NKT-лимфоцитами (CD3+CD16+CD56+) – 0-4%.Исходно у 38% больных КРР отмечалось снижение относительногочисла В-лимфоцитов, у 42% - повышение содержания Тreg-клеток и у 59% –увеличение количества NK-клеток. Количество активированных лимфоцитов(HLA-DR+) у больных в среднем составило 19,9±6,8%, CD25+клеток –12,5±5,6%, CD38+ – 31,3±11,3%, а CD69+ – 20,7±10,5%.
Среднее содержаниерецептора NKG2D на всех лимфоцитах составило 44,3±11,6%, а на NK-клетках– 18,1±10,9% (рис. 24).146B-кл.CD45RA 807045RORACD45ROCD69+Т-кл.*CD69+NK-кл*CD69CD38+Т-кл.6050403020100******CD38NKG2D+NKТhTreg***Т-кл.*NKG2D*CTLNKТ-кл.NK-кл.HLA-DR+Т-кл.HLA-DRCD25 (IL2ɑ)0 day3 dayРисунок 24. Изменение поверхностной экспрессии маркеров активации на культивируемых лимфоцитах больных КРР в среде с IL-2 сразу после выделения ина 3 день (в %).* значимое отличие количества клеток до и после активации МНК (p<0,05).К 3 дню культивирования в среде с IL-2 на лимфоцитах больных КРР значимо увеличилась экспрессия активирующего СD25 и СD38 в 1,7 раз, а HLA-DRи СD314 – в 1,5 раза (р<0,05).
Экспрессия раннего активационного маркера CD69в свою очередь увеличилась на всех лимфоцитах к 3 дню в 2,9 раз (р=0,005), а наNK-клетках – в 2,2 раза (р=0,02) (рис. 24). Количество юных форм лимфоцитов(CD45+RA+) у двух групп больных постепенно уменьшалось, а количество зрелых клеток памяти (CD45+RO+) увеличивалось в процессе культивирования, такая тенденция сохранялась до окончания наблюдения. Доля NK-клеток у больных КРР при этом увеличилась на 2,5%, а доля Тreg значительно не изменилась.У больных меланомой прирост субпопуляции NK-клеток был выше в 1,9раз (р=0,003) в сравнении с исходными показателями (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
