Диссертация (1139494), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Биохимические методы исследованияДля достижения поставленной цели нами был использован индивидуальныйклинико-лабораторный мониторинг биохимических показателей крови с учетомпринимаемой пациентом схемы АРВТ.В качестве основных лабораторных маркеров во всех трех группахиспользовали аланинаминотранспептидазу (АЛТ), аспартатаминотранспептидазу(АСТ), фракции билирубина и холестерина, гамма глютамин транспептидазу(ГГТ), лактат дегидрогеназу (ЛДГ), щелочную фосфатазу (ЩФ), триглицериды,креатинин, глюкозу, а также микроэлементы - калий (К), кальций (Са) и магний(Mg).
За весь период наблюдения все пациенты проходили динамическоеклинико-лабораторное обследование и наблюдение не менее 2-3 раз в год сопределением спектра биохимических показателей крови, клинического анализакрови, концентрации РНК ВИЧ и Т-клеточной субпопуляции лимфоцитов.Клинический осмотр и обследование пациентов проводились стандартнымметодом.Лабораторная часть исследования выполнялась в СНИО ЭП СПИДа и вЦентре молекулярной диагностики ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии.Исследования проводили через 3-6, 9-12 и 12-24 месяца от начала АРВТ.Для оценки степени токсичности препаратов у больных ВИЧ-инфекциейприменялась шкала градации изменений лабораторных показателей крови,определяющая степень токсичности принимаемой терапии.Использованыследующиесокращения:Ст.–степень(кратностьпревышения от верхней границы международных норм измерения), мм/л –(милимоль на литр), мкм/л – (микромоль на литр).Повышение биохимических показателей крови (билирубина, АЛТ, АСТ,липопротеидов, ЛДГ, ГГТ, креатинин и т.д.) до 1-2 степени оценивалось какнезначительное повышение от верхней границы международных норм (на 1015%), самостоятельно купировались без медикаментозного вмешательства присоблюдении приверженности (режим приема препаратов, дня и питания).103Повышение биохимических показателей до 2-3-й степени расценивались какумеренно выраженное повышение от верхней границы международных норм(более чем на 25-30%), не купировалось самостоятельно и возникаланеобходимость медикаментозного вмешательство для нормализации показателейили же коррекция (частичная замена) схемы АРВТ.Повышение до уровня 3-4 степени (более чем на 35-40%) от верхнейграницы норм оценивалось как выраженные нарушения метаболизма тех илииных органов и систем, снижение качества жизни, возможная угроза жизнипациента,не купировалосьсамостоятельно,ивозникаланеобходимостьмедикаментозного вмешательства для нормализации показателей или же отменапринимаемой схемы.Все лабораторные исследования проводились в течение одного дня.2.8.
Анализ хромосомных генов человека2.8.1. Исследование аллеля HLA-B*5701Данная часть работы была выполнена в сотрудничестве с НИИ вирусологииим. Д. И. Ивановского МЗ РФ в лаборатории вирусных лейкозов подруководством д.б.н. М.Р.Бобковой.Анализ наличия/отсутствия аллеля генома человека HLA-B*5701 назначалипо показаниям, то есть в тех случаях, когда в ходе лечения пациентапредполагалась возможность назначения ему препарата Абакавир (ABC) илиABC-содержащих комбинированных препаратов TZV или ABC/3ТС. Для анализаприменяли метод in-house, разработанный в НИИ вирусологии им.
Д. И.Ивановского МЗ РФ и прошедший апробацию на значительном числе образцов[179].Выделение геномной ДНК из клеток крови проводили с применениемнаборов QIAmp DNA Blood Mini Kit и прибора QIAсube (Qiagen, США) всоответствии с инструкциями производителя.104ДетекциюаллеляHLA-B*5701осуществлялиспомощьюметодаполимеразной цепной реакции с высокоспецифичными праймерами (sequencespecific primers, PCR-SSP) производства «Литех», г.
Москва.Положительным считался результат при наличии в геле трех полосразмером 439 п.н. (внутренний контроль, HGH), 211 п.н. (HLA-B*57, группоспецифическийфрагментДНК)и130п.н.(собственноHLA-B*5701),соответственно; во всех остальных случаях результат считался отрицательным.Пример анализа представлен на рисунке 3.439 нпHGH193 нпB*57112 нпB*5701Рис.3.HLA5701.Типичныйрезультатэлектрофоретическогоанализапродуктов SSР-ПЦР.Стрелками слева указан размер фрагментов ДНК в нуклеотидах. Нижняяполоса в треках 1 и 2 соответствует неиспользованным в реакции ПЦР праймерам.1, 2 – отрицательные образцы ДНК, 3 – положительный образец ДНК2.8.2.
Анализ аллелей G2677T/A, C3435T, C1236TДанная часть работы была выполнена в сотрудничестве с НИИ вирусологииим. Д. И. Ивановского МЗ РФ в лаборатории вирусных лейкозов подруководством д.б.н. М.Р.Бобковой.Детекцию SNP С1236T (12 экзон), G2677A (21 экзон) и C3435T (26 экзон)осуществляли с помощью метода полимеразной цепной реакции с последующимрестрикционным анализом (RFLP-PCR).
Праймеры («Литех», г. Москва) и105рестриктазы (BsuRI, RsaI, MboI (Fermentas, Литва) использовали, как описано(таблица 11). Режим амплификации: 95ºC — 10 мин; 35 циклов: 95ºC — 30 с, 55ºC— 30 с, 72ºC — 30 с; последний этап 72ºC — 7 мин. ПЦР-продукты подвергалиобработке рестриктазами, соответствующими определенному участку мутации,затем анализировали в 5%-ном полиакриламидном геле (C3435T, С1236Т иG2677A).Детекцию SNP G2677T (21 экзон) проводили методом Real-Time PCR.Праймеры и зонды для Real-Time PCR были разработаны ранее в лаборатории наоснове данных, полученных из GenBank, а также собственных результатовсеквенирования образцов ВИЧ-1, принадлежащих доминирующему в Россииварианту вируса подтипа А.
Конечная концентрация праймеров и зондовсоставляла 500 мкM и 200 мкM, соответственно. Условия амплификации: 95ºC —3 мин; 35 циклов: 95ºC — 10 с, 60ºC — 30 с (iQ5, Bio-Rad). Результаты Real-TimePCR анализировали с помощью программного обеспечения Bio-Rad.Метод PCR-RFLP, оптимизированный для наших исследований, позволяетидентифицировать дикий, гетерозиготный и гомозиготный варианты трехполиморфных сайтов гена С1236T, G2677A и C3435T гена MDR1.
Типичныерезультаты анализа данным методом на примере C1236T представлены нарисунке 4.106Рис.4. С1236T.Результаты электрофоретического анализа продуктов рестрикции ПЦР-продукта сиспользованием фермента BsuRI:1,2 - гомозигота по мутации, 3, 4 – гомозигота – дикий тип, 5, 6– гетозигота.На рисунке показано, что в результате ДНК-электрофореза продуктоврестрикции ПЦР-продукта ферментом BsuRI в случае присутствия мутации вобеих аллелях (гомозигота по мутации) обнаруживаются две полосы размером118 и 96 нуклеотидов, а при отсутствии мутации в обеих аллелях (гомозигота –дикий тип) наблюдаются полосы размером 118, 61 и 35 нуклеотидов;гетерозиготный вариант проявляет все указанные полосы.
Аналогичный анализналичия мутации C3435T позволяет наблюдать набор полос размером 213, 172,88 и 42 нуклеотида, а анализ мутации G2677A проводится по сочетанию полосразмером 124,106, 82 и 24 нуклеотида.Для выявления альтернативного аллеля G2677T была проведена работа поподбору и оптимизации праймеров, флуоресцентных зондов и условий ихиспользования для разработки модельного метода Real-Time. Разработанныйметодпозволилувереннодифференцироватьдикий,гетерозиготныйи107гомозиготный варианты полиморфного аллеля G2677T.
На рисунке 5 (А, Б)представлены результаты типичного опыта в двух форматах: график накоплениясигнала по циклам и график распределения генотипа аллелей в квадрантной сеткев зависимости от накопленного сигнала.108Рис.5А. G2677TА. График распределения генотипа аллелей G2677T в зависимости отнакопленного сигнала, где D3 — мутантная гомозигота; D6 — гетерозигота;D5,D4 — гомозиготы без мутации; D7- отрицательный контроль.109Рис.5Б.
G2677TБ. График накопления сигнала по циклам с использованием двух флуоресцентныхметок (HEX и FAM), где A — накопление сигнала гомозиготного образца смутацией; B — накопление сигнала гомозиготного образца дикого типа; C —накопление сигнала гетерозиготного образца.1102.8.3. Анализ геномной ДНК человекаДанная часть работы была выполнена в сотрудничестве с Центроммолекулярной медицины Каролинского института, Стокгольм, Швеция.ГенотипированиеГеномная ДНК была выделена из клеток периферической крови влаборатории вирусов лейкозов НИИ вирусологии им. Д.
И. Ивановского. Послеспектрометрического контроля качества концентрацию раствора ДНК приводилик нормализованной величине (4 нг/мкл в воде). По 5 мкл раствора каждогообразца ДНК вносили в индивидуальную лунку 384-луночного планшета постандартной схеме (робот Biomek FX, Beckman Coulter) и высушивали в течениеночи при комнатной температуре, после чего планшет герметично закрывалипластиковой пленкой и хранили при -20°С до использования.Генотипированиепроводилиспомощьюметодааллельногодискриминирования с использованием TaqMan SNP genotyping Assay Kit (AppliedBiosystems, США), содержащим специфические праймеры для амплификациианализируемого локуса и две олигопробы для каждого аллеля, меченые VIC- иFAM-флуоресцентнымикрасителями,соответственно.Былопроведеногенотипирование 15 однонуклеотидных вариантов (SNP): rs10800098, rs1367951,rs17762150, rs17762192, rs1799945, rs2575735, rs3020450, rs3869068, rs10468473,rs5968255, rs2854116, rs1799987, rs8321, rs4244285 и rs4149056 Реагенты длягенотипирования, включая универсальный ПЦР-мастер-буферный раствор исвободную от ДНKаз воду, добавляли в лунки планшета с высушенной ДНК израсчета 5 мкл/лунку.
Планшет герметично закрывали специальной пластиковойпленкой, проводили амплификацию согласно стандартному протоколу сприменением GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, США) ианализировали с использованием программы SDS, версия 2.3)2.8.4. Фенотипирование111Для проведения исследований геномной ДНК человека и связи рядахромосомных аллелей с параметрами естественного течения и эффективностилечения ВИЧ-инфекции на основании опроса и обследования пациентовпроводилиоценкунекоторыхихсостояний,включаядислипидемию,липодистрофию и симптомы проявления расстройства ЦНС на фоне приема EFV .Дислипидемия определялась как повышение одного из факторов выше указанногоуровня: общий холестерин >5,2 мМ/литр, HDL-холестерин >1,55мМ/литр, LDLхолестерин >3,30 мМ/литр, триглицериды >1,71, атерогенный коэффициент >3,5.Клинически липодистрофию диагностировали в случае, когда при внешнемосмотре у пациентов - мужчин наблюдалось перераспределение жира поженскому типу, в виде накопления жира в области бедер и таза и на шее, в товремя как заострялись черты лица, худое лицо и конечности на фоне увеличенияталии и живота.Прочие показатели (биохимические, иммунологические, ВН и др.) получаликоличественную оценку.2.9.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
