Часть 3 (1129751), страница 39
Текст из файла (страница 39)
Визуализация клеток 1047Рис. 9.39. Молекулы, меченные радиоизотопами. Три доступные из коммерческих источников радиоактивные формы АТP. Радиоактивные атомы показаны красным. Такжена рисунке показана номенклатура, принятаядля обозначения положения и типа радиоактивного атома.темнопольном и светлопольноммикроскопах. Все виды световоймикроскопии могут использоватьсяв сочетании с методами обработки изображений, которые служатдля усиления чувствительностии очистки изображения. Конфокальная микроскопия и обращеннаясвертка позволяют получать тонкие оптические срезы и воссоздаватьтрехмерные изображения.Сейчас существуют методыобнаружения, измерения и слеженияза практически любой нужной молекулой в живой клетке.
Флуоресцентные индикаторные красителипозволяют измерять концентрацииопределенных ионов в отдельныхклетках или в разных частях клеток. Флуоресцентные белки представляют собой особенно удобные зонды,которые можно присоединить к другим белкам при помощи генетических манипуляций. Практически любой интересующий белок можно экспрессироватьв форме флуоресцентного химерного белка и визуализировать его в клеткепри помощи флуоресцентной микроскопии. Динамическое поведение и взаимодействия многих соединений, часто на уровне единственной молекулы, можнонаблюдать в живых клетках, используя различные флуоресцентные белковыеметки. Радиоактивные изотопы также можно применять для биохимическогои микроскопического наблюдения за судьбой определенных молекул.9.2. Изучение клетки и молекулы в электронный микроскопСветовая микроскопия ограничена в разрешении.
Микроскопы, в которыхиспользуют другие типы излучения, — в особенности электронные микроскопы – способны разрешать гораздо меньшие структуры, чем световые микроскопы.За большее разрешение приходится платить: процесс приготовления препаратовдля электронной микроскопии значительно сложнее.
Более того, трудно сказать,насколько соответствует то, что мы видим на изображении, реальной исследуемойструктуре. Однако сейчас стало доступным очень быстрое замораживание для сохранения структур для электронной микроскопии. Цифровой анализ изображенийможно использовать для восстановления трехмерных объектов, объединяя инфор-1048Часть III. МетодыРис. 9.40. Радиоавтография. Данную ткань непродолжительноевремя обрабатывали 3H-тимидином.
Клетки, реплицировавшиесвою ДНК, включили метку в ядро, что позволило визуализировать их при помощи радиоавтографии. Серебряные зерна,видимые здесь на фотографической эмульсии на поверхностисреза как черные точки, указывают на клетки, синтезирующиеновую ДНК.
Изображенные здесь меченые ядра принадлежатнейроэпителию внутреннего уха цыпленка. (С любезного разрешения Mark Warchol и Jeffrey Corwin.)мацию о множестве отдельных частиц или изображения единственного объекта,полученные под разными углами. В сочетании эти подходы увеличивают разрешениеи возможности электронной микроскопии до уровня, на котором становится возможным получать адекватные изображения структуры отдельных макромолекули образуемых ими комплексов.9.2.1. Электронный микроскоп разрешает тонкую структуру клеткиЗависимость предела разрешения от длины волны освещения (см.
рис. 9.6)справедлива для любого вида излучения, будь то луч света или пучок электронов.Однако в случае электронов предел разрешения можно сделать очень маленьким.Длина волны электрона уменьшается с увеличением его скорости. В электронноммикроскопе с ускоряющим напряжением 100 000 В длина волны электрона составляет 0,004 нм.
В теории разрешение такого микроскопа должно быть около 0,002нм, что в 100 тысяч раз меньше, чем у светового микроскопа. Однако, посколькуаберрации магнитных линз корректировать значительно сложнее, чем неровностистеклянных линз, на практике разрешающая способность большинства современныхэлектронных микроскопов составляет, в лучшем случае 0,1 нм (1 Å) (рис. 9.41).Это происходит потому, что используется только самый центр магнитной линзы,и в результате эффективная числовая апертура очень мала.
Более того, сложностиРис. 9.41. Предельное разрешение электронного микроскопа. На данной микрофотографии, полученной при помощи трансмиссионного электронного микроскопа, показан тонкий слой золота. Яркиепятна — это отдельные цепочки атомов в кристалле. Расстояние между соседними цепочками атомовсоставляет примерно 0,2 нм (2 Å). (С любезного разрешения Graham Hills.)Глава 9. Визуализация клеток 1049Рис. 9.42.
Принципиальное строение световогомикроскопа и трансмиссионного электронногомикроскопа. На данном рисунке отмечено сходствовнутреннего устройства микроскопов. Стекляннымлинзам светового микроскопа в электронном микроскопе соответствуют магнитные катушки. В электронном микроскопе необходимо, чтобы образец находился в вакууме. На фотографии показан рабочийтрансмиссионный микроскоп. (Фотография приведена с юбезного разрешения FEI Company Ltd.)с приготовлением препаратов, контрастностью и радиационными повреждениямиснизили нормальное эффективное разрешение биологических объектов до 1 нм(10 Å).
Однако это все равно в 200 разлучше, чем у светового микроскопа. Такжев последние годы производительность электронных микроскопов значительно улучшена благодаря развитию новых источников пучка электронов — автоэлектронныхэмиссионных пушек. Эти очень яркие и когерентные источники могут в будущемулучшить достигнутое на данный момент разрешение.В целом устройство трансмиссионного (просвечивающего) электронного микроскопа (ТEМ) сходно с таковым светового микроскопа, но он значительно большеи «перевернут вверх ногами» (рис. 9.42).
Источником освещения служит нить накаливания или катод, испускающий электроны в верхней части цилиндрическойколонки высотой около 2 м. Поскольку электроны рассеиваются при столкновении1050Часть III. Методыс молекулами воздуха, воздух из колонки должен откачиваться для создания вакуума. Затем электронам нити накаливания при помощи расположенного рядоманода придается ускорение, и они, проходя через очень маленькое отверстие,формируют пучок, который идет вниз по колонке. Магнитные катушки, расположенные по всей длине колонки фокусируют электронный пучок точно так же,как стеклянные линзы фокусируют свет в световом микроскопе. Препарат черезвоздушную разделительную камеру помещают в вакуум на пути пучка электронов. Как и в световой микроскопии, препарат обычно окрашен — в данном случаеэлектронно-плотным веществом (см.
следующий раздел). Некоторые проходящиечерез образец электроны рассеиваются структурами, окрашенными электронноплотным веществом; остальные фокусируются для формирования изображенияаналогично построению изображения в световом микроскопе. Изображение можнонаблюдать на люминесцентном экране или записать на фотопластинку или цифровуюкамеру высокого разрешения. Поскольку рассеянные электроны уходят из пучка,на изображении плотные участки препарата соответствуют областям сниженногопотока электронов и выглядят темными.9.2.2. Биологические образцы нужно специально подготавливатьдля электронной микроскопииВ первые дни применения к биологическим объектам электронная микроскопияпозволила увидеть множество ранее невообразимых структур клетки.
Но до тогокак эти открытия могли быть сделаны, микроскопистам пришлось разработатьновые методы фиксации, разрезания и окрашивания тканей.Поскольку в электронном микроскопе препарат подвергается воздействиюглубокого вакуума, живую ткань обычно убивают и сохраняют путем фиксациисначала глутаральдегидом, который ковалентно связывает молекулы белков с ихсоседями, а затем тетраоксидом осмия, который, связываясь с липидными бислоями, стабилизирует их и белки (рис.
9.43). Поскольку электроны обладаюточень ограниченной проникающей способностью, до того, как смотреть на фиксированные ткани, их надо очень тонко нарезать (толщина срезов должна быть около50–100 нм, что составляет примерно 1/200 толщины клетки). Для этого образецобезвоживают и пропитывают мономерной смолой, которая полимеризуется с образованием единого пластикового блока; затем блок нарезают в микротоме тонкимстеклянным или алмазным ножом. Такие тонкие срезы (микросрезы), лишенныеводы и других испаряющихся растворителей, затем помещают на маленькую круглую металлическую сетку для наблюдения в микроскопе (рис.
9.44).Этапы приготовления биологического материала для визуализации в электронном микроскопе с самого начала создавали трудноРис. 9.43. Два распространенных химических фиксатора, применяемых в электронной микроскопии. Две реакционно-способныегруппы глутаральдегида позволяют ему сшивать различные типымолекул, формируя между ними ковалентные связи. Тетраоксидосмия образует поперечно сшитые комплексы со многими органическими соединениями, в процессе чего он восстанавливается.Данная реакция особенно полезна для фиксации клеточных мембран, поскольку двойные связи C = C, присутствующие во многихжирных кислотах, взаимодействуют с тетраоксидом осмия.Глава 9.
Визуализация клеток 1051Рис. 9.44. Медная сетка, поддерживающая тонкийсрез образца в ТEМ.сти для исследователей. Откуда нам знать,что наконец-то видимое нам изображениефиксированного, обезвоженного и заключенного в смолу препарата хоть как-то соответствует хрупкой и заполненной водойбиологической системе, которая исходноприсутствовала в клетке? Наилучший современный подход к этой проблеме основанна быстром замораживании. Если воднуюсистему достаточно быстро охладить до достаточно низкой температуры, вода и другиекомпоненты системы не успевают реорганизоваться или кристаллизоваться до льда.Вместо этого вода переохлаждается до жесткого, но некристаллического состояния,называемого стекловидным льдом. Такого состояния можно достичь несколькимиспособами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
