Часть 3 (1129751), страница 36
Текст из файла (страница 36)
Cell Sci. 115:1703–1715, 2002. С любезного разрешения The Company of Biologists.)(обычно заменой единственной аминокислоты) для синтеза белковых форм, которыев нормальных условиях возбуждения флуоресцируют слабо, но которые можно заставить интенсивно флуоресцировать путем активации их ярким лучом света отличнойдлины волны. По существу, микроскопист затем может in vivo следить за локальным поведением любого белка, который может быть экспрессирован как химерныйбелок с одной из таких форм GFP. Благодаря таким генетически закодированнымфотоактивируемым флуоресцентным белкам отпадает необходимость введения зондав клетку. Более того, они позволяют изучать жизненный цикл и поведение любогобелка независимо от других заново синтезированных белков (рис.
9.30).Третьим способом применения химерных белков с GFP является использование сфокусированного пучка света лазера для тушения флуоресценции GFPв определенной области клетки. Анализ временной зависимости того, как оставшиеся молекулы флуоресцентного белка мигрируют в отбеленную область, позволяетполучить информацию о кинетических параметрах белка. Данный метод, обычнотребующий использования конфокального микроскопа, известен как восстановление флуоресценции после фотоотбеливания (ВФПФ; Fluorescence Recovery afterГлава 9.
Визуализация клеток 1035Рис. 9.29. Визуализация движения микротрубочек в митотическом веретене деления при помощи «запертого» флуоресцеина, связанного с тубулином. (а) В метафазное веретено деления, образовавшеесяin vitro в экстракте икринок Xenopus, включены три флуоресцентных маркера: меченный родаминомтубулин (красный) для маркирования всех микротрубочек, синий ДНК-связывающий краситель для мечения хромосом и меченный «запертым» флуоресцеином тубулин, который также встраивается во всемикротрубочки, но его не видно, потому что он не флуоресцирует до активации ультрафиолетовымсветом.
(б) Луч УФ-света локально активирует меченный «запертым» флуоресцеином тубулин слеваот метафазной пластинки. В течение следующих нескольких минут (на в — через 1,5 минуты, на г —через 2,5 минуты) сигнал «запертого» флуоресцеина-тубулина мигрирует к левому полюсу веретенаделения. Это указывает на то, что тубулин постоянно движется, хотя веретено деления (видимое благодаря красной флуоресценции меченного родамином тубулина) остается большей частью неизменным.(Из K. E.
Sawin and T. J. Mitchison, J. Cell Biol. 112: 941–954, 1991. С любезного разрешения The RockefellerUniversity Press.)Photobleaching, FRAP) и, как и фотоактивация, может дать ценные количественныеданные об интересующем белке, например, коэффициенты диффузии, скоростиактивного транспорта или скорости связывания и диссоциации при взаимодействиис другими белками (рис. 9.31).9.1.11. Испускающие свет индикаторы позволяют измерять быстроизменяющиеся внутриклеточные концентрации ионовОдин из способов изучения химии отдельной живой клетки — прямое введениево внутренний объем клетки через плазматическую мембрану кончика тонкого стеклянного ион-селективного микроэлектрода. Этот метод используют для измерениявнутриклеточной концентрации неорганических ионов, например H+, Na+, K+, Clи Ca2+.
Однако ион-селективные микроэлектроды измеряют концентрацию ионовтолько в одной точке клетки, и для ионов, концентрация которых мала, напримерCa2+, сигнал медленный и нестабильный. При этом такие микроэлектроды не приспособлены для регистрации быстрых и нестационарных изменений концентрациицитоплазматического Ca2+, играющего важную роль в ответе клеток на внеклеточныесигналы.
Такого рода изменения можно анализировать при помощи ион-селективныхиндикаторов, испускание света которыми отражает локальную концентрацию ионов. Эти индикаторы делятся на испускающие свет спонтанно (люминесцентные)и при освещении (флуоресцентные).1036Часть III. МетодыРис. 9.30. Фотоактивация. Фотоактивация — это вызываемый светом переход молекулы из инертногосостояния в активное. В данном эксперименте фотоактивируемая форма GFP экспрессируется в культивированной животной клетке. До активации (время 0) в выбранной области (красный круг) при возбуждении синим светом с длиной волны 488 нм флуоресценция GFP не регистрируется совсем или ееуровень очень низок.
Однако после активации GFP при помощи пучка света лазера с длиной волны413 нм GFP в выбранной области начинает ярко флуоресцировать (зеленый). Можно количественноописать движение GFP при его диффузии из этой области. Поскольку в клетке флуоресценцией обладают только активированные молекулы, можно наблюдать за путями миграции, оборота и деградациибелков. (б, из J. Lippincott-Schwartz and G. H. Patterson, Science 300: 87–91, 2003. С любезного разрешенияиздательства AAAS.)Экворин — это люминесцентный белок, выделенный из морской медузы; ониспускает свет в присутствии Ca2+ и реагирует на изменение концентрации Ca2+в пределах от 0,5 µМ до 10 µМ.
Например, при введении в яйцеклетку эквориниспускает вспышку света в ответ на внезапное локальное высвобождение Ca2+в цитоплазму, которое происходит при оплодотворении (рис. 9.32). Экворин такжеэкспрессировали методами генной инженерии в растениях и других организмахдля получения метода наблюдения ионов Ca2+ во всех клетках без необходимостипроведения микроинъекций, что может быть непростой процедурой.Биолюминесцентные молекулы типа экворина испускают очень маленькоеколичество света, в лучшем случае несколько фотонов на одну индикаторнуюмолекулу, которые сложно измерить. Флуоресцентные индикаторы производятна порядок больше фотонов в расчете на одну молекулу; таким образом, их прощеизмерять, и они дают лучшее пространственное разрешение.
Синтезировали флуоресцентные индикаторы для Ca2+, которые крепко связывают Ca2+ и поглощают илииспускают свет немного различающихся длин волн в свободном и связанном с Ca2+состояниях. Измеряя отношение интенсивностей флуоресценции при двух длинахволн возбуждения или испускания, можно определить отношение концентрацийсвязанного с Ca2+ индикатора и свободного индикатора, и, таким образом, аккуратно измерить концентрацию свободного Ca2+. Такого рода индикаторы используютдля посекундного наблюдения за изменением концентрации внутриклеточного Ca2+в различных частях клетки в флуоресцентном микроскопе (рис.
9.33).Глава 9. Визуализация клеток 1037Рис. 9.31. Восстановление флуоресценции после фотоотбеливания (FRAP). Интенсивный сфокусированный свет лазера тушит, или отбеливает, флуоресценцию GFP. Путем селективного фотоотбеливаниянабора флуоресцентно меченых белков в заданной области клетки микроскопист может во временинаблюдать восстановление, по мере того как оставшиеся флуоресцентные молекулы мигрируют в отбеленную область. В эксперименте, показанном на (а), использовались клетки обезьяны в культуре,синтезирующие галактозилтрансферазу, фермент, который постоянно циркулирует между аппаратомГольджи и эндоплазматическим ретикулумом. Аппарат Гольджи в одной из двух клеток был фотоотбелен,а синтез нового флуоресцирующего белка был блокирован путем обработки клеток циклогексимидом.Восстановление, происходящее в результате миграции флуоресцентного фермента из ЭР в Гольджи,можно наблюдать во времени.
(б) Схема эксперимента, показанного на (а). (а, из J. Lippincott-Schwartzet al., Histochem. Cell Biol. 116: 97–107, 2001. С любезного разрешения Springer-Verlag.)Сходные флуоресцентные индикаторы применяют для измерения других ионов;некоторые, например, реагируют на H+ и, следовательно, позволяют определить pH.Некоторые из этих индикаторов могут проникать в клетку посредством диффузии,и поэтому их не надо вводить микроинъекцией; это позволяет одновременно наблюдать во флуоресцентный микроскоп большое количество отдельных клеток. Новыетипы индикаторов, используемые в сочетании с современными методами обработкиизображений, привели к возникновению быстрых и точных методов анализа изменений концентрации множества различных малых молекул в клетке.9.1.12. Доступно несколько методов введения в клетку веществ,для которых мембрана непроницаемаЧасто бывает полезно ввести в живую клетку молекулы, для которых мембрана непроницаема.
Это могут быть антитела, узнающие внутриклеточные белки,нормальные белки клетки, меченные флуоресцентным маркером, или молекулы,1038Часть III. МетодыРис. 9.32. Экворин, люминесцентный белок. Люминесцентный белок экворин испускает свет в присутствии свободного Ca2+. Здесь в яйцеклетку рыбы медаки ввели экворин, который диффундировалпо всему цитозолю.
Затем яйцеклетку оплодотворили сперматозоидом и наблюдали при помощи высокочувствительной камеры. С интервалом в 10 секунд сделаны четыре фотографии со стороны точки входасперматозоида. На изображениях видны волны высвобождения в цитозоль Ca2+ из внутриклеточныхдепо под поверхностью плазматической мембраны. Эта волна распространяется от места проникновения сперматозоида по всей яйцеклетке, как показано на рисунках слева. (Фотографии воспроизведеныиз J. C. Gilkey, L. F. Jaffe, E. B. Ridgway and G. T. Reynolds, J.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
