Часть 3 (1129751), страница 33
Текст из файла (страница 33)
(С любезногоразрешения Kevin F. Sullivan.)9.1.6. Антитела можно использовать для обнаружения определенных молекулАнтитела — это белки, синтезируемые в иммунной системе позвоночныхдля защиты против инфекции (см. обсуждение в главе 24). Это уникальныебелки, поскольку они синтезируются в миллиардах различных форм, каждая изкоторых несет отличный сайт связывания, узнающий определенную молекулумишень (или антиген). Высокая специфичность антител к антигенам делает ихэффективным инструментом в руках клеточного биолога.
Меченные флуоресцентными зондами антитела незаменимы для обнаружения при помощи флуоресцентноймикроскопии специфических молекул в клетках (рис. 9.17). Меченные электронноплотными частицами, например частицами коллоидного золота, антитела применяютдля сходных целей в электронной микроскопии (см. ниже).Рис. 9.16. Флуоресцентные наночастицы, или квантовые точки.
Квантовые точки — это мельчайшиенаночастицы полупроводника селенида кадмия, покрытые специальным соединением для того, чтобыони стали растворимыми в воде (а). Их можно сшивать с белковыми зондами, например антителамиили стрептавидином. При введении в клетку они будут связываться с интересующим белком. Квантовыеточки разных размеров испускают свет разных длин волн — чем больше точка, тем больше длина волны, — но возбуждаются они одинаковым синим светом. (б) Квантовые точки, в отличие от большинстваорганических красителей, способны светиться неделями. В данной клетке ядерный белок (зеленый)помечен органическим флуоресцентным красителем (Alexa 488), а микротрубочки окрашены (красный)квантовыми точками, сшитыми со стрептавидином.
При продолжительном освещении синим светомфлуоресцентный краситель быстро выцветает, тогда как квантовые точки продолжают флуоресцировать. (б, из X. Wu et al. Nat. Biotechnol. 21: 41–46, 2003. С любезного разрешения издательства MacmillanPublishers Ltd.)1024Часть III. МетодыРис. 9.17. Иммунофлуоресценция. (а) Микрофотография края культивированной клетки эпителия, полученная при помощи трансмиссионного электронного микроскопа. Видно распределение микротрубочеки других филаментов.
(б) Та же область, окрашенная флуоресцентными антителами против тубулина,белка, из которого собираются микротрубочки. Изображение получено при помощи метода непрямойиммуноцитохимии (см. рис. 9.18). Красные стрелки указывают на отдельные микротрубочки, видимыена обоих изображениях. Обратите внимание, что за счет дифракции в световом микроскопе толщинамикротрубочек кажется равной 0,2 мкм, хотя реальный их диаметр составляет 0,025 мкм. (M. Osborn,R. Webster and K. Weber, J. Cell Biol.
77: R27–R34, 1978. С любезного разрешения The Rockefeller UniversityPress.)При использовании антител для обнаружения и анализа определенных молекул в клетках мы часто усиливаем сигнал флуоресценции химическими методами.Например, несмотря на то что такая маркерная молекула, как флуоресцентныйкраситель, может быть напрямую сшита с используемым для специфическогоузнавания антителом — первичным антителом, — более сильный сигнал можнополучить при помощи немеченого первичного антитела, которое затем взаимодействует со связывающим его набором меченых вторичных антител (рис. 9.18).Этот процесс носит название непрямой иммуноцитохимии.В наиболее чувствительных методах усиления сигнала в качестве маркерноймолекулы, сшитой со вторичным антителом, используют фермент. Фермент щелочная фосфатаза, например, в присутствии соответствующих химических соединенийдает неорганический фосфат, который, в свою очередь, приводит к образованиюокрашенного осадка.
В результате можно определить локализацию вторичногоантитела и, следовательно, местоположение комплекса антиген-антитело. Поскольку каждая молекула фермента катализирует реакцию образования тысяч молекулпродукта, можно обнаружить даже очень маленькое количество антигена. Основанный на данном принципе твердофазный иммуноферментный анализ (англ.Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) в планшетах часто используетсяв медицине в качестве очень чувствительного метода анализа, например, в тестах набеременность или различные типы инфекций. Несмотря на то что ферментативноеусиление делает иммуноферментные анализы очень чувствительными, диффузияГлава 9. Визуализация клеток 1025Рис.
9.18. Непрямая иммуноцитохимия. Данный метод обнаружения очень чувствителен, посколькукаждое первичное антитело узнается множеством молекул вторичного антитела. Вторичные антителаковалентно связаны с маркерной молекулой, позволяющей их легко обнаружить. В качестве такихмолекул широко используют флуоресцентные красители (для флуоресцентной микроскопии), ферментпероксидазу хрена (для обычной световой микроскопии или электронной микроскопии), частицы коллоидного золота (для электронной микроскопии) и ферменты щелочную фосфатазу или пероксидазу(для биохимического обнаружения).окрашенного осадка ограничивает пространственное разрешение данного методав микроскопии.
Для более точной визуальной локализации используют флуоресцентные красители.Антитела проще всего получать путем многократного введения образца антигена в организм животного, например кролика или козы, и последующего сбораобогащенной антителами сыворотки.
Такая иммунная сыворотка, или антисыворотка, содержит неоднородную смесь антител, каждое из которых синтезированоотличной антитело-секретирующей клеткой (B-лимфоцитом). Различные антителаузнают различные части молекулы антигена (называемые антигенными детерминантами, или эпитопами), а также посторонние примеси в образце антигена. Удалениенежелательных молекул антител, связывающих другие молекулы, увеличиваетспецифичность иммунной сыворотки к определенному антигену; например, антисыворотка к белку X при пропускании через колонку для аффинной хроматографии,содержащей антигены X, будет связываться с ними, а остальные антитела пройдутнасквозь. Затем очищенное анти-X антитело можно элюировать из колонки. Однаконеоднородность таких иммунных сывороток иногда ограничивает их применимость.Эта проблема решается путем использования моноклональных антител (смотририс. 8.8).
Впрочем, с моноклональными антителами также связаны некоторые проблемы. Поскольку это белковые антитела одного вида, они демонстрируют практически идеальную специфичность к единственному сайту или эпитопу на антигене,но доступность эпитопа и, следовательно, эффективность антитела, может зависетьот процесса приготовления образца. Например, некоторые моноклональные антитела будут взаимодействовать только со свободными антигенами, другие — толькопосле использования определенных фиксаторов, а третьи — только с белками,денатурированными в полиакриламидном геле в присутствии ДСН, а не с белкамив их нативной конформации.9.1.7. Оптический микроскоп позволяет визуализировать сложныетрехмерные объектыКак мы видели, в случае обычной световой микроскопии необходимо изготовить тонкие срезы ткани; чем тоньше срез, тем четче изображение.
В результате1026Часть III. Методыпроцесса изготовления срезов мы теряем информацию о третьем пространственном измерении. Как тогда можно получить изображение трехмерной архитектурыклетки или ткани, и как мы можем увидеть микроскопическую структуру образца,который, по какой-либо причине нельзя сперва нарезать? Несмотря на то что оптический микроскоп фокусируется на определенной фокальной плоскости в пределахсложного трехмерного образца, все остальные части образца, расположенные нижеи выше плоскости фокуса, также освещаются. Свет, исходящий от этих областей,также вносит вклад в изображение, давая расфокусированную размытость. В результате интерпретация деталей изображения может значительно усложниться,а тонкая структура станет неясной за счет света «не в фокусе».Эту проблему решают при помощи двух различных, но дополняющих другдруга подходов: вычислительного и оптического.
Эти методы построения трехмерного микроскопического изображения позволяют сфокусироваться в толстомобразце на выбранной плоскости, игнорируя свет, идущий от расфокусированныхобластей под и над этой плоскостью. Таким образом, можно увидеть четкий, тонкий оптический срез. Из набора таких оптических срезов, сделанных на разнойглубине образца, на компьютере легко восстановить трехмерное изображение. Этиметоды дают микроскопистам то же, что томография (другими способами) даетрадиологам, изучающим человеческое тело: оба аппарата воссоздают подробныеизображения срезов внутреннего устройства интактной структуры.Вычислительный подход часто называют обращенной сверткой изображения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
