Часть 3 (1129751), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Такие методы, как ДНК-чипы, позволяютодновременно наблюдать за экспрессией тысяч генов, что дает нам подробныеи всесторонние «снимки» динамического поведения генной экспрессии, лежащегов основе сложных клеточных процессов.ЗадачиКакие из этих утверждений соответствуют действительности? Объясните почему8.1. Поскольку моноклональное антитело узнает только специфический антигенный сайт (эпитоп), оно связывается только с тем белком, против которого онобыло создано.8.2. Благодаря неотвратимости технологического прогресса кажется неизбежным, что в конце концов чувствительность методов детекции молекул превыситйоктомольный уровень (10–24 моль).8.3.
Поверхностный плазмонный резонанс (SPR) измеряет константы ассоциации kon и диссоциации koff молекул в реальном времени, используя небольшиеГлава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 1005количества немеченых молекул, но он не дает информации, необходимой для определения константы связывания.8.4. Если в каждом цикле ПЦР удваивается количество ДНК, синтезированной в предыдущем цикле, то 10 циклов увеличат содержание ДНК в 103 раз,20 циклов — в 106 раз, а 30 циклов — в 109 раз.Решите следующие задачи8.5. При выделении животных клеток из образца ткани их обрабатывают трипсином, коллагеназой и ЭДТА.
Почему такая обработка необходима, и что делаеткаждый из компонентов? Почему такая обработка не убивает клетки?8.6. Как вы думаете, станет ли возможным получение антитела к другомуантителу? Объясните свой ответ.8.7. Объясните разницу между методами скоростной седиментации и седиментационного равновесия. Для каких целей используется каждый из них? Какой из них,по вашему мнению, больше подходит для разделения двух белков разного размера?8.8. Коэффициент седиментации тропомиозина, масса которого составляет93 кДа, равен 2,6 S, тогда как коэффициент седиментации гемоглобина массой65 кДа равен 4,3 S. (Коэффициент седиментации S является линейной мерой скорости седиментации: оба увеличиваются или уменьшаются параллельно.) Моделиα-углеродных скелетов этих двух белков изображены на рис. Q8.1.
Почему болеекрупный белок осаждается медленнее, чем небольшой? Можете ли вы придуматьаналогию из повседневной жизни, которая могла бы помочь ответить на этотвопрос?8.9. В классической работе, которая доказала полуконсервативную репликацию ДНК, Месельсон (Meselson) и Сталь (Stahl) начали с того, что показали, какДНК сама по себе будет формировать полосу при седиментационном равновесии.Они смешали случайным образом расщепленную ДНК E. coli с раствором CsCl.Плотность конечного раствора составила 1,71 г/мл.
Как показано на рис. Q8.2,с увеличением продолжительности центрифугирования при 70 000 g ДНК, котораясначала была распределена по всей центрифужной пробирке, сконцентрироваласьв полосе в центре.А. Объясните, что происходит со временем и почему ДНК формирует выраженную полосу.Б. Чему равна плавучая плотность ДНК? (Плотность раствора, при которойДНК «плавает» в равновесии определяет ее «плавучую плотность».)В. Даже если бы ДНК центрифугировали в два раза дольше, ширина полосыостанется примерно такой же, как внизу рис.
Q8.2. Почему полоса не становитсяболее узкой? Предложите несколько возможных объяснений ширины полосы ДНКв равновесии.8.10. Метод гибридом позволяет создавать моноклональные антитела практически к любому белку. Почему же тогда мечение белков эпитопами настолькоРис. Q8.1. Модели углеродных скелетов тропомиозина и гемоглобина (задача 8.8).1006Часть III. МетодыРис. Q8.2. Фотографии поглощения ультрафиолета, показывающие последовательные стадии образования полосы ДНК E. coli(задача 8.9). ДНК, поглощающая ультрафиолет, на фотографияхвыглядит как темные области. Дно центрифужной пробирки расположено справа.
(M. Meselson and F. W. Stahl, Proc. Natl Acad. Sci.U.S.A. 44: 671–682, 1958. С любезного разрешения Национальнойакадемии наук США.)распространенная практика, особенно если учесть,что эпитопные метки могут влиять на функционирование белка?8.11. Сколько копий белка должно присутствовать в клетке, чтобы его можно было увидетьв геле? Предположим, что вы можете поместить в гель100 мкг клеточного экстракта и зарегистрировать припомощи окрашивания серебром 10 нг. Концентрация белка в клетке составляет примерно 200 мг/мл,типичный объем клетки млекопитающего равен примерно 100 мкм3, а бактерии — 1 мкм3. При данныхзначениях параметров рассчитайте количество копийбелка массой 120 кДа в клетках млекопитающего и бактерии, необходимых длятого, чтобы белок давал видимую полосу в геле.
До точных расчетов можете оценить порядок величины.8.12. Вы хотите амплифицировать ДНК между двумя участками последовательности, показанными на рис. Q8.3. Выберите из приведенных праймеров те,которые позволят вам амплифицировать ДНК при помощи ПЦР.8.13. На самом первом этапе ПЦР с использованием геномной ДНК с праймеровначинается синтез, который заканчивается только по завершении цикла (или когдавстречается случайный конец ДНК). Однако в конце 20 или 30 циклов (обычноечисло для амплификации) единственный видимый продукт точно определяетсяконцами праймеров. В каком цикле впервые синтезируется двухцепочечный фрагмент правильного размера?8.14. Объясните разницу между мутацией с приобретением функциии доминантно-негативной мутацией.
Почему обе эти мутации обычно бывают доминантными?Рис. Q8.3. ДНК для амплификации и потенциальные праймеры ПЦР (задача 8.12).Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 10078.15. Обсудите следующее утверждение: «Мы не имели бы сегодня ни малейшего представления о значении инсулина как регуляторного гормона, если бы егоотсутствие не было связано с тяжелым заболеванием человека – диабетом. Толькосерьезные последствия его отсутствия направили ранние исследования в сторонуидентификации и изучения нормальной роли инсулина в физиологии».ЛитератураОбщаяAusubel F. M., Brent R., Kingston R. E. et al.
(eds) (2002) Short Protocols inMolecular Biology, 5th ed. New York: Wiley.Brown Т. А. (2002) Genomes 2, 2nd ed. New York: Wiley-Liss.Spector D. L., Goldman R. D. & Leinwand L. A. (eds) (1998) Cells: A LaboratoryManual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.Watson J. D., Caudy A. A., Myers R. M. & Witkowski J. A. (2007) RecombinantDNA: Genes and Genomes—A Short Course, 3rd ed.
New York: WH Freeman.Выделение клеток и выращивание их в культуреEmmert-Buck M. R., Bonner R. F., Smith P. D. et al. (1996) Laser capturemicrodissection. Science 274: 998-1001.Ham R. G. (1965) Clonal growth of mammalian cells in a chemically defined,synthetic medium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53: 288–293.Harlow E. & Lane D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual. ColdSpring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.Herzenberg L. A., Sweet R. G. & Herzenberg L. A. (1976) Fluorescence-activatedcell sorting.
Sci. Am. 234: 108–116.Levi-Montalcini R. (1987) The nerve growth factor thirty-five years later. Science237: 1154–1162.Lerou P. H. & Daley G. Q. (2005) Therapeutic potential of embryonic stem cells.Blood Rev. 19: 321–31.Milstein С. (1980) Monoclonal antibodies. Sci. Am. 243: 66–74.Очистка белковde Duve С. & Beaufay H. (1981) A short history of tissue fractionation. J. Сеll.Biol. 91: 293s–299s.Krogan N. J., Cagney G., Yu H. et al. (2006) Global landscape of protein complexesin the yeast Saccharomyces cerevisiae.
Nature 440: 637–43.Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of bacteriophage T4. Nature 227: 680–685.Nirenberg M. W. & Matthaei J. H. (1961) The dependence of cell-free proteinsynthesis in E. coli on naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.
Proc.Natl. Acad. Sci. USA 47: 1588–1602.O'Farrell P. H. (1975) High-resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.J. Biol. Chem. 250: 4007–4021.Palade G. (1975) Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science189: 347–358.Scopes R. K. & Cantor C. R. (1994) Protein Purification: Principles and Practice,3rd ed. New York: Springer-Verlag.1008Часть III. МетодыАнализ белковBranden С. &Tooze J. (1999) Introduction to Protein Structure, 2nd ed. NewYork: Garland Science.Fields S. & Song О. (1989) A novel genetic system to detect protein-proteininteractions. Nature 340: 245–246.Giepmans B. N., Adams S. R.
et al. (2006) The fluorescent toolbox for assessingprotein location and function. Science 312: 217–24.Kendrew J. C. (1961) The three-dimensional structure of a protein molecule. Sci.Am. 205: 96–111.Knight Z. A. & Shokat K. M. (2007) Chemical genetics: Where genetics andpharmacology meet. Cell 128: 425–30.Rigaut G., Shevchenko A., Rutz В. et al. (1999) A generic protein purificationmethod for protein complex characterization and proteome exploration. NatureBiotechnol. 17: 1030–1032.Washburn M. P., Wolters D.
and Yates J. R. (2001) Large-scale analysis ofthe yeast proteome by multidimensional protein identification technology. NatureBiotechnol. 19: 242–7.Wuthrich К.(1989) Protein structure determination in solution by nuclear magneticresonance spectroscopy. Science 243: 45–50.Выделение, клонирование и секвенирование ДНКAdams M. D., Celniker S. E., Holt R. A. et al.
(2000) The genome sequence ofDrosophila melanogaster. Science 287: 2185–2195.Alwine J. C., Kemp D. J. & Stark G. R. (1977) Method for detection of specificRNAs in agarose gels by transfer to diabenzyloxymethyl-pape rand hybridization withDNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 74: 5350–5354.Blattner F. R., Plunkett G., Bloch C. A. et al. (1997) The complete genomesequence of Escherichia coli K-12. Science 277: 1453–1474.Cohen S., Chang A., Boyer H. & Helling R. (1973) Construction of biologicallyfunctional bacterial plasmids in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 3240–3244.International Human Genome Sequencing Consortium (2000) Initial sequencingand analysis of the human genome. Nature 409: 860–921.International Human Genome Sequencing Consortium (2006) The DNA sequence,annotation and analysis of human chromosome 3.
Nature 440: 1194–1198.Jackson D., Symons R. & Berg P. (1972) Biochemical method for insertingnew genetic information into DNA of simian virus 40: circular SV40 DNA moleculescontaining lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 69: 2904–2909.Maniatis T.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
