Часть 3 (1129751), страница 27
Текст из файла (страница 27)
(в) Эмбрион червяна той же стадии развития, в котором ген, участвующий в деленииклеток, был инактивирован RNAi. Пронуклеусы не могут мигрировать.(б и в из P. Gönczy et al., Nature 408: 331–336, 2000. С любезного разрешения издательства Macmillan Publishers Ltd.)Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 9978.5.17. Репортерные гены и гибридизация in situ показывают, гдеи когда экспрессируется генВажную информацию о функции гена часто можно получить, исследуя, когдаи где ген экспрессируется в клетке или в целом организме.
Определить временныеи пространственные принципы экспрессии генов можно путем замены кодирующейчасти интересующего гена репортерным геном. В большинстве случаев за экспрессией гена-репортера наблюдают посредством измерения флуоресценции илиферментативной активности его белкового продукта (см. рис. 9.26 и 9.27).Как подробно описано в главе 7, регуляторные последовательности ДНК, расположенные справа или слева от кодирующего участка, контролируют экспрессиюгена. Эти последовательности, точно определяющие, когда и где ген будет экспрессироваться, легко исследовать, поместив под их контроль репортерный ген и введятакие рекомбинантные ДНК в клетку (рис. 8.70).Рис. 8.70. Использование репортерного белка для определения пространственного распределения экспрессии гена.
(а) В данном примере кодирующая последовательность белка X заменяется кодирующей последовательностью репортерного белка Y. Картины экспрессии генов X и Y совпадают. (б) Для создания тестовых молекулДНК, кодирующих репортерный ген Y, в различных комбинациях добавляют фрагменты ДНК, содержащиевозможные регуляторные последовательности. Затем проверяют экспрессию этих рекомбинантных молекулДНК после их трансфекции в различные типы клеток млекопитающих. Результаты приведены на рис. (в).998Часть III.
МетодыТакже можно напрямую наблюдать время и место экспрессии мРНК гена.Несмотря на то что обычно такой подход дает такую же информацию, что и использование репортерного гена, бывают случаи, когда он может предоставитьдополнительные сведения; например, когда ген транскрибируется, а мРНК транслируется не сразу, или когда конечным продуктом гена служит РНК, а не белок.Этот метод, носящий название гибридизации in situ, основан на описанных вышепринципах гибридизации нуклеиновых кислот. Обычно ткань мягко фиксируют, такчто ее РНК сохраняется в свободной форме, способной к гибридизации с меченымикомплементарными зондами ДНК или РНК. Таким образом, можно наблюдатьхарактер дифференциальной экспрессии генов в ткани и определять месторасположение в клетках определенных РНК (рис.
8.71). В эмбрионе Drosophila, например,такой подход дал новую информацию о механизмах формирования различий междуклетками в различных частях зародыша во время развития (см. главу 22).Используя сходные подходы, можно визуализировать определенные последовательности ДНК в клетке. В данном случае препараты тканей, клеток или дажехромосом на короткое время подвергают действию сильнощелочного pH для расщепления нуклеотидных пар.
Затем добавляют зонды нуклеиновых кислот, позволяютим гибридизоваться с ДНК клетки и получают визуализацию (см. рис. 8.35).В экспериментах на эукариотических клетках чаще всего используют дварепортерных белка: фермент β-галактозидазу (β-gal) (см.
рис. 7.55, б) и зеленыйфлуоресцентный белок (GFP) (см. рис. 9.26). На рис. 7.55, б приведен примериспользования гена β-gal для наблюдения за активностью регуляторной последовательности гена Eve в эмбрионе Drosophila.Рис. 8.71. Гибридизация in situ для локализации РНК. (а) Пространственное распределение экспрессиимРНК DeltaC в раннем эмбрионе рыбки данио. Этот ген кодирует лиганд в Notch-сигнальном пути (описанном в главе 15), а показанное здесь распределение отражает его роль в развитии сомитов — будущихсегментов позвоночного столба и хвоста.
(б) Локализация высокого разрешения РНК in situ показывает,где в ядре клетки горошка синтезируется рибосомальная РНК. Толстые тяжи диаметром 0,5–1 мкм соответствуют петлям хромосомной ДНК, содержащей кодирующие рРНК гены. Каждое маленькое белоепятно представляет собой транскрипцию единственного гена рРНК. (С любезного разрешения Yun-JinJiang; Peter Shaw (б).)Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 9998.5.18. Экспрессия отдельных генов может быть измеренапри помощи количественной полимеразной цепной реакциис обратной транскрипциейНесмотря на то что методы репортерных генов и гибридизации in situ показывают, где и когда экспрессируются гены, часто бывает полезным количественноописать экспрессию, напрямую измерив уровень мРНК в клетке. Для этого можноадаптировать нозерн-блоттинг (см.
рис. 8.38), но существует более точный метод,основанный на принципе ПЦР (рис. 8.72). В этом методе, носящем название количественной ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией),исходным материалом служит вся популяция молекул мРНК, выделенных из тканиили клеточной культуры. Важно, чтобы в образце не содержалось ДНК; ее необходимо удалить или ферментативно деградировать. Добавляют два праймера ДНК,совпадающих с интересующим геном, обратную траскриптазу, ДНК-полимеразуи четыре дезоксинуклеозидтрифосфата, необходимых для синтеза ДНК.
Первыйэтап синтеза состоит в обратной транскрипции мРНК в ДНК с использованиемодного из праймеров. Затем последовательные циклы нагревания и охлажденияпозволяют ДНК размножиться при помощи обычного ПЦР (см. рис. 8.45). Количественная часть данного метода основана на прямом соотношении между скоростьюобразования продуктов ПЦР и концентрацией интересующей мРНК в исходномобразце. Добавляя в реакцию ПЦР химические красители, флуоресцирующие только при связывании с двухцепочечной ДНК, простая регистрация интенсивностифлуоресценции позволяет проследить за ходом реакции и, таким образом, точноопределить исходную концентрацию амплифицируемой мРНК (см.
рис. 8.72). Хотяописание метода может показаться сложным, проводить количественную ОТ-ПЦР(иногда называемую ПЦР в реальном времени) в лаборатории относительно легкои быстро. ОТ-ПЦР заменила нозерн-блоттинг в качестве метода количественногоописания уровня мРНК гена.8.5.19. ДНК-чипы позволяют одновременно следить за экспрессиейтысяч геновДо сих пор мы рассматривали методы, применяемые для наблюдений за экспрессией только одного гена (или относительно небольшого их числа).
В 90-е годыразработаны ДНК-чипы, совершившие переворот в анализе экспрессии генов. Онипозволяют одновременно следить за РНК-продуктами тысяч генов. Благодаря этомуметоду мы начинаем обнаруживать и изучать принципы экспрессии генов, лежащиев основе физиологии клетки: мы можем увидеть, какие гены включаются (или вы-Рис. 8.72. Уровень мРНК можно измерить при помощи количественной ОТ-ПЦР. Измеряемую флуоресценцию создаюткрасителем, который флуоресцирует только при связываниис двухцепочечными ДНК-продуктами реакции ОТ-ПЦР (см.рис. 8.46, б).
Красный образец имеет большую концентрациюмРНК, чем синий, так как ему для достижения полумаксимальнойконцентрации двухцепочечной ДНК необходимо меньше цикловПЦР. На основании этих различий можно точно определить относительное содержание мРНК в двух образцах.1000Часть III. Методыключаются), когда клетки растут, делятся, дифференцируются или подвергаютсядействию гормонов или токсинов.ДНК-чипы — это не просто предметные стекла, утыканные большим числомфрагментов ДНК, каждый из которых несет последовательность нуклеотидов, служащую зондом для определенного гена.
Наиболее компактные из этих чипов могутсодержать десятки тысяч таких фрагментов на области меньшей, чем почтовая марка,что позволяет параллельно протекать тысячам реакций гибридизации (рис. 8.73).Некоторые ДНК-чипы приготавливают из полученных при помощи ПЦР крупныхфрагментов ДНК, которые робот затем помещает на предметное стекло. Другиесодержат короткие олигонуклеотиды, синтезированные на поверхности стекляннойпластинки методами, подобными вытравливанию электросхем на компьютерныхчипах. В любом случае известна точная последовательность и расположение каждого зонда на чипе.
Таким образом, любой нуклеотидный фрагмент, вступающийна чипе в реакцию гибридизации с зондом, может быть идентифицирован как продукт конкретного гена просто по положению, в котором он связался.Чтобы использовать ДНК-чипы для наблюдения за экспрессией генов, сначалаиз исследуемых клеток выделяют мРНК и переводят ее в кДНК (см. рис. 8.43).Затем кДНК метят флуоресцентными зондами. Микрочип инкубируют с этиммеченым образцом кДНК, чтобы прошла реакция гибридизации (см. рис.
8.73).Затем микрочип промывают, удаляя некрепко связанную кДНК, и определяютположение на чипе связавшихся фрагментов ДНК при помощи автоматическогосканирующего лазерного микроскопа. Положения на микрочипе затем соотносятс определенным геном, чей образец ДНК обнаружен в данной точке.Обычно флуоресцирующую ДНК из экспериментальных образцов (меченную, например, красным флуоресцентным красителем) смешивают с контрольнымобразцом фрагментов кДНК, меченных флуоресцентным красителем другогоцвета (например, зеленого). Таким образом, если в интересующей клетке количество экспрессированной РНК от этого конкретного гена возрастает по сравнениюс контрольным образцом, получившееся пятно будет красным. И наоборот, еслиэкспрессия гена снижается по сравнению с контрольным образцом, пятно будетзеленым. Если изменений нет, пятно будет желтым.
Используя такое внутреннеесравнение, можно составлять очень точные профили экспрессии генов.На данный момент ДНК-чипы используют для изучения чего угодно: от изменения экспрессии генов, вызывающего созревание клубники, до отличительных чертэкспрессии генов различных типов человеческих раковых клеток (см. рис. 7.3); илиот изменений, происходящих в ходе клеточного цикла, до изменений, вызванныхвнезапными перепадами температур.
В самом деле, поскольку микрочипы позволяютодновременно следить за большим количеством генов, они позволяют обнаружитьтонкие изменения в клетке, изменения, которые могут никак не проявляться в еевнешнем виде или поведении.Подробное изучение экспрессии генов также дает дополнительный слой информации, полезной для предсказания функций генов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
