Часть 3 (1129751), страница 28
Текст из файла (страница 28)
Ранее мы обсуждали, какидентификация белков-партнеров может пролить свет на функцию данного белка.Сходный принцип работает и для генов: информация о функции гена может бытьполучена путем идентификации генов, обладающих такой же картиной экспрессии.Используя метод кластерного анализа, можно обнаружить наборы генов, которыерегулируются скоординированно.
Гены, которые включаются и выключаются вместепри различных условиях, скорее всего, работают в клетке совместно: они могутГлава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 1001Рис. 8.73. Использование ДНК-чипов для одновременного наблюдения за экспрессией тысяч генов.Чтобы приготовить микрочип, фрагменты ДНК, каждый из которых соответствует гену, автоматическипомещают на предметное стекло. Существует большое число уже готовых коммерческих микрочипов.В приведенном примере мРНК выделяют из двух различных клеточных образцов для прямого сравненияих относительных уровней экспрессии генов.
Например, образцы можно взять из клеток, обработанныхгормоном, и клеток того же типа, но нетронутых. Эти образцы переводят в кДНК и метят, один — краснымфлуорохромом, другой — зеленым. Меченые образцы смешивают и на микрочипе проводят реакциюгибридизации. После инкубации чип отмывают и измеряют флуоресценцию. В приведенной частимикрочипа, соответствующей 110 дрожжевым генам, красные пятна указывают на то, что ген в образце1 экспрессируется сильнее, чем соответствующий ген в образце 2; зеленые пятна указывают на то, чтоэкспрессия гена в образце 2 выше, чем в образце 1. Желтые пятна соответствуют генам, экспрессиякоторых в обоих образцах одинакова. Темные пятна указывают на слабую экспрессию или полное ееотсутствие в обоих образцах гена, чей фрагмент расположен в данной точке микрочипа.
(Микрочип получен J. L. DeRisi et al., Science 278: 680–686, 1997. С любезного разрешения издательства AAAS.)1002Часть III. Методыкодировать белки, входящие в состав одного мультисубъединичного комплекса,или белки, выполняющие сложную скоординированную функцию, например, репликацию ДНК или сплайсинг РНК. Описание гена с неизвестной функцией путемего группировки с известными генами, обладающими таким же транскрипционнымповедением, иногда называют «виной в соучастии». Кластерный анализ используютдля анализа профилей экспрессии генов, лежащих в основе многих интересныхбиологических процессов, включая заживление ран у людей (рис.
8.74).Помимо наблюдения за уровнем мРНК, соответствующим каждому генугенома, ДНК-чипы имеют множество других применений. Например, их можноиспользовать для слежения за ходом репликации ДНК в клетке (см. рис. 5.32) и,в сочетании с иммунопреципитацией, для определения участков генома, занятыхрегуляторными белками данного гена (см. рис.
7.32). Микрочипы также можноиспользовать для быстрой идентификации вызывающих болезни микробов путемгибридизации ДНК инфицированных тканей с чипами, содержащими последовательности геномной ДНК больших наборов патогенов.8.5.20. Анализ экспрессии генов в одной клетке выявляет биологический «шум»Описанные выше методы мониторинга мРНК дают средние уровни экспрессии каждой мРНК для большой популяции клеток. Используя флуоресцентныйрепортерный белок, чья экспрессия находится под контролем интересующего промотора, можно точно измерять уровни экспрессии отдельных клеток.
Такие новыеподходы выявили удивительный уровень вариабельности в пределах отдельныхклеток однородной популяции, часто называемый биологическим шумом. Этиисследования также показали, что в популяциях присутствуют отдельные субпопуляции, чье существование было бы не замечено, если бы рассматривали среднеепо всей популяции. Например, бимодальное распределение уровней экспрессииуказало бы на то, что клетки могут существовать в двух различных состояниях(рис.
8.75). Тогда средний уровень экспрессии популяции был бы промежуточныммежду ними. Поведение отдельных клеток имеет важное значение для пониманиябиологии, например, указывая на то, что некоторые клетки постоянно и оченьбыстро переходят из одного состояния в другое.В настоящее время существует два подхода для мониторинга экспрессии геновв отдельных клетках. Во-первых, живые клетки можно поместить на предметноестекло и наблюдать в флуоресцентный микроскоп.
Преимущество этого методасостоит в том, что определенную клетку можно наблюдать во времени, измеряяизменения экспрессии. Во-вторых, в проточной цитометрии разбавленный растворклеток пропускают мимо источника света и измеряют интенсивность флуоресценцииотдельных клеток, когда они проходят мимо детектора (см. рис. 8.2). Достоинствомэтого метода является то, что можно точно измерять уровни экспрессии множестваклеток, но проточная цитометрия не позволяет наблюдать определенную клеткуво времени, следовательно, она лишь дополняет микроскопические методы.ЗаключениеГенетика и генетическая инженерия предоставляют эффективные методыизучения функционирования генов как в клетках, так и в целых организмах.В классическом генетическом подходе случайный мутагенез сочетается со скри-Рис.
8.74. Использование кластерного анализа для идентификации наборов генов, регулируемых совместно. Гены, принадлежащие одному кластеру,могут участвовать в одном и том же метаболическом пути или процессе. Для проведения кластерного анализа при помощи микрочипов получают данныедля клеточных образцов в различных условиях, и гены, проявляющие скоординированные изменения экспрессии, объединяют в одну группу.
В данномэксперименте фибробласты человека 48 часов держали в условиях нехватки сыворотки. Отсчет времени вели после добавления к культурам сыворотки,и клетки собирали для анализа на микрочипах в различные моменты времени. Из 8 600 генов, проанализированных на ДНК-чипе, только чуть более 300показали трехкратные и выше изменения экспрессии в ответ на повторное введение сыворотки. Здесь красным показано усиление экспрессии, зеленым — ее ослабление. На основе результатов многих экспериментов с микрочипами 8 600 генов объединены в кластеры в соответствии со сходнымипрофилями экспрессии.
Результаты этого анализа показывают, что гены, участвующие в заживлении ран, в ответ на сыворотку крови включаются, тогдакак гены, участвующие в регуляции хода клеточного цикла и биосинтеза холестерина, выключаются. (Из M. B. Eisen et al., Proc.
Natl Acad. Sci. U.S.A. 95:14863–14868, 1998. С любезного разрешения Национальной академии наук США.)Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 10031004Часть III. МетодыРис. 8.75. Различные уровни экспрессии генов отдельныхклеток в популяции бактерии E. coli. В данном экспериментев клетки бактерий ввели два различных репортерных белка(один, флуоресцирующий, — зеленым, другой — красным),контролируемых копией одного промотора. При освещениинекоторые клетки экспрессируют только одну копию гена,и, следовательно, выглядят красными или зелеными, тогдакак другие клетки экспрессируют обе копии и выглядят желтыми.
Этот эксперимент также показывает разные уровнифлуоресценции, что говорит о различных уровнях экспрессиигенов в пределах на первый взгляд однородной популяцииклеток. (M. B. Elowitz, A. J. Levine, E. O. Siggia and P. S. Swain,Science 297: 1183–1186, 2002. С любезного разрешения издательства AAAS.)нингом для идентификации мутантов, обладающих дефектами в определенныхбиологических процессах. Затем эти мутанты используют для локализациии изучения генов, ответственных за этот процесс.Функции генов также можно установить при помощи обратной генетики. Методы инженерии ДНК могут быть использованы для изменения генови введения их в хромосомы, где они становятся постоянной частью генома.Если для переноса генов используют оплодотворенные яйцеклетки (в случаеживотных) или тотипотентные растительные клетки в культуре, можно получить трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающиеего по наследству.
Для клеточной биологии особенно важны методы крайнеспецифического изменения клеток и организмов, позволяющие уловить влияниена клетку или организм изменения отдельного белка или молекулы РНК. Многие из этих методов стали применять для изучения функций геновв масштабе генома. Создание библиотек мутаций, в которых каждый отдельныйген организма систематически удален или нарушен, предоставляет незаменимыеинструменты для исследования роли каждого гена в продуманном молекулярноммеханизме, дающем начало жизни.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
