Часть 3 (1129751), страница 32
Текст из файла (страница 32)
Полученное в результатеобработанное изображение значительно легче интерпретировать. Обратите внимание: микротрубочкидинамичны и некоторые из них изменили свою длину или положение между изображениями «до и после». (С любезного разрешения Viki Allan.)Глава 9. Визуализация клеток 1019Обычно даже после фиксации ткани остаются мягкими и хрупкими, поэтомуперед изготовлением срезов их необходимо поместить в поддерживающую среду.Большей частью в качестве среды для заливки используют воски или смолы. В жидком состоянии эти среды проникают в фиксированную ткань и окружают ее; затемих можно сделать твердыми (путем охлаждения или полимеризации).
В результатеполучают твердый блок, из которого легко изготовить срезы на микротоме — приборес острым лезвием, работающем как ломтерезка (рис. 9.10). Затем срезы (толщиной1–10 мкм) помещают на поверхность приборного стекла микроскопа.В клетках (на 70 % состоящих из воды) содержится мало компонентов, способных задержать прохождение световых лучей. Поэтому большинство клетокв естественном состоянии, даже после фиксации и изготовления срезов, практически невидимы в обычный световой микроскоп. Существует три основных подхода к работе со срезами ткани, позволяющих увидеть клетки сами по себе илиопределенные их компоненты.Во-первых, традиционно срезы обрабатывают органическими красителями,обладающими специфическим сродством к определенным субклеточным компонентам. Краситель гематоксилин, например, обладает сродством к отрицательнозаряженным молекулам и в результате позволяет увидеть распределение в клеткеДНК, РНК и кислых белков (рис.
9.11). Однако химические принципы специфичности многих красителей неизвестны.Во-вторых, срезы тканей можно использовать для визуализации специфическихпрофилей дифференциальной экспрессии генов. Гибридизация in situ, которуюмы обсуждали выше (стр. 573), показывает распределение клеток и содержаниеопределенных молекул РНК в срезе материала или тотальном препарате маленького организма или органа (рис. 9.12).
Третий и очень чувствительный подход,повсеместно применяемый для локализации интересующих белков, основан на использовании флуоресцентных зондов и маркеров (см. ниже).9.1.5. Определенные молекулы можно обнаружить в клеткахпри помощи флуоресцентной микроскопииФлуоресцентные молекулы поглощают свет одной длины волны и испускаютсвет большей длины волны. Если мыбудем освещать такое соединение егодлиной волны поглощения и смотреть нанего через фильтр, пропускающий только свет испускаемой длины волны, то мыувидим светящуюся молекулу на темномфоне.
Поскольку фон будет темным,можно обнаружить даже ничтожное количество флуоресцентного красителя.Наблюдая обычными методами такое жечисло молекул простого красителя, мыРис. 9.10. Изготовление срезов ткани. На рисунке показано, как для исследования в световоммикроскопе фиксированной ткани в микротомепредварительно изготавливают ее срезы.1020Часть III. МетодыРис. 9.11. Окрашивание клеточных компонентов. (а) Данный срез собирательных трубочек почекокрашен двумя красителями, гематоксилином и эозином, широко используемыми в гистологии.
Каждаятрубочка состоит из плотно прилегающих клеток (их ядра окрашены красным), формирующих кольцо.Кольцо окружено внеклеточным матриксом, окрашенным фиолетовым. (б) Данный срез молодогокорня растения обработан двумя красителями, сафранином и прочным зеленым. Прочный зеленыйокрашивает целлюлозные клеточные стенки, тогда как сафранин окрашивает одревесневшие клеткиксилемы в ярко-красный. (а, из P. R. Wheater et al., Functional Histology, 2nd ed. London: Churchill Livingstone,1987; б, с любезного разрешения Stephen Grace.).практически ничего не увидим, так как молекулы будут лишь немного окрашеныпри просвечивании меченой части образца.Флуоресцентные красители, используемые для мечения клеток, можно увидеть в флуоресцентный микроскоп.
Этот микроскоп похож на обычный световой,за исключением того, что свет из мощного источника проходит через два наборафильтров: один фильтр отрезает ненужные длины волн до того, как они достигнутобразца, другой фильтрует свет, испускаемый образцом. Первый фильтр пропускаеттолько те длины волн, которые возбуждают данный флуоресцентный краситель,тогда как второй блокирует этот свет и пропускает только длины волн, испускаемыепри флуоресценции образца (рис.
9.13).Флуоресцентную микроскопию чаще всего применяют для обнаружения определенных белков или других молекул в клетках и тканях. Очень эффективныйи широко распространенный метод — присоединение флуоресцентных красителейк молекулам антител, которые затем служат в качестве высокоспецифичных и универсальных окрашивающих реагентов, селективно связывающихся с определеннымимакромолекулами, которые они узнают в клетках или внеклеточном матриксе. С этойцелью широко применяют два флуоресцентных красителя. Во-первых, это флуоресцеин с ярко-зеленой флуоресценцией при возбуждении синим светом. Во-вторых,это родамин, испускающий темно-красный свет при возбуждении зелено-желтымсветом (рис. 9.14).
Сшивая одно антитело с флуоресцеином, а другое — с рода-Глава 9. Визуализация клеток 1021Рис. 9.12. Гибридизация РНК in situ. В главе 8 (см. рис. 8.71) описано, как при помощи гибридизацииin situ можно визуализировать распределение различных РНК в тканях. Здесь на примере одногоэмбриона плодовой мушки показан транскрипционный профиль пяти различных генов, участвующихв формировании раннего зародыша. Все зонды РНК флуоресцентно помечены различными способами(напрямую или косвенно).
Результирующие изображения были ложно окрашены и совмещены так,чтобы каждый отдельный транскрипт был хорошо виден. Здесь показаны профили экспрессии геновwingless (желтый), engrailed (синий), short gastrulation (красный), intermediate neuroblasts defective (зеленый) и muscle specific homeobox (фиолетовый). (D. Kosman et al., Science 305: 846, 2004. С любезногоразрешения издательства AAAS.)Рис. 9.13. Оптическая система флуоресцентного микроскопа. Набор фильтров состоит из фильтров возбуждения (1), эмиссии (или запирающего фильтра) (3) и дихроичного (светоделительного) зеркала (2).Здесь показан пример набора фильтров для регистрации флуоресцентной молекулы флуоресцеина.В данном виде микроскопии особенно важно наличие объективов с высокой числовой апертурой, поскольку при данном увеличении яркость флуоресцентного изображения пропорциональна четвертойстепени числовой апертуры (см.
также рис. 9.6).1022Часть III. МетодыРис. 9.14. Флуоресцентные зонды. Показаны максимальные длины волн поглощения и испускания нескольких широко применяемых флуоресцентныхзондов в соответствии с цветовым спектром. Фотон,испускаемый флуоресцентной молекулой, обязательнообладает меньшей энергией (большей длиной волны),чем поглощенный фотон. Этим можно объяснить разницу между максимумами поглощения и флуоресценции.CFP, GFP, YFP и RFP — это голубой, зеленый, желтыйи красный флуоресцентные белки соответственно. Этоне красители, и мы подробно обсудим их ниже в этойглаве.
ДАФИ (4,6-диамедино-2-фенил, англ. DAPI) широко используют в качестве общего флуоресцентного зонда ДНК. Он поглощает УФ и флуоресцирует ярко-синим.ФИТЦ (англ. FITC) — это сокращение для флуоресцеинаизотиоцианата, широко применяемого производного флуоресцеина, испускающего ярко-зеленый свет.Остальные зонды обычно используют для флуоресцентного мечения антител и других белков.мином, можно сравнивать распределениеразличных молекул в клетке. Молекулыкрасителей в микроскоп будут видны по отдельности при переключении между двумянаборами фильтров, каждый из которыхспецифичен к определенному красителю.Как показано на рис.
9.15, точно так жеможно использовать три флуоресцентных метки для локализации трех различныхмолекул в одной и той же клетке. В последнее время разработано несколько специальных красителей для флуоресцентной микроскопии; к ним относятся, например, Cy3, Cy5 и Alexa (см. рис. 9.14). Эти органические флуорохромы обладаютнесколькими недостатками. Они возбуждаются светом очень узкого промежуткадлин волн (хотя для разных красителей длины волн разные) и довольно быстротускнеют при постоянном освещении.
Однако недавно разработаны более стабильные неорганические флуорохромы. Мельчайшие кристаллы полупроводниковыхматериалов, называющиеся наночастицами, или квантовыми точками, возбуждаются широким спектром синего света. Цвет испускаемого ими света зависитот точного размера нанокристалла, диаметр которого обычно находится в пределахот 2 до 10 нм. Более того, их флуоресценция очень медленно затухает со временем(рис. 9.16).
Эти наночастицы после присоединения к другим зондам, напримерантителам, идеально подходят для наблюдения за молекулами во времени. Послевведения в живую клетку, например в эмбрион, потомков исходной клетки можнонаблюдать даже через несколько дней по их флуоресценции. Таким образом, можнопрослеживать клеточные линии.Методы флуоресцентной микроскопии, обсуждаемые ниже в этой главе, можнотакже применять для наблюдения за изменением концентрации и местоположенияопределенных молекул внутри живых клеток (см. стр. 592).Глава 9.
Визуализация клеток 1023Рис. 9.15. Флуоресцентная микроскопия с несколькими зондами. Для получения даннойкомпозиционной микрофотографии клеткив митозе использованы три различных флуоресцентных зонда для окрашивания трех различных клеточных компонентов. Микротрубочкиверетена деления помечены зеленым флуоресцентным антителом, центромеры — красным,а ДНК конденсированных хромосом — синимфлуоресцентным красителем DAPI.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
