Часть 3 (1129751), страница 34
Текст из файла (страница 34)
Чтобы понять то, как он работает, вспомним, что за счет волновой природысвета в системе линз микроскопа точечный источник света видится как маленькийразмытый диск (см. рис. 9.5). Его размытость возрастает, если источник светалежит ниже или выше фокальной плоскости. Такое размытое изображение точечного источника света называют функцией рассеяния точки. Тогда каждую точкупрепарата можно заменить на соответствующий размытый диск. В результате мыполучим размытое изображение сложного объекта. Для обращенной свертки мы,обычно при помощи охлажденной камеры с ПЗС, сначала получаем набор (размытых) изображений, поочередно фокусируя микроскоп на разных фокальныхплоскостях.
Затем набор цифровых изображений обрабатывается компьютером длямаксимально возможного избавления от размытости. По существу, компьютернаяпрограмма использует функцию рассеяния точки микроскопа для определениятого, как повлияет размытость на изображение, и затем применяет эквивалентную«обратную размытость» (обращенную свертку), превращая нечеткое трехмерноеизображение в набор чистых оптических срезов.
Требуемые вычисления довольносложны и раньше серьезно ограничивали исследователей. Однако сейчас, когдакомпьютеры стали быстрее и дешевле, метод обращенной свертки изображения набирает популярность. На рис. 9.19 показан пример применения данного подхода.9.1.8. Конфокальный микроскоп позволяет получить оптическиесрезы путем исключения расфокусированного светаКонфокальный микроскоп решает ту же задачу, что и обращенная свертка, но путем манипуляции светом перед его измерением; это аналоговый метод,а не цифровой.
Оптическая система конфокального микроскопа очень сложна, ноосновной принцип, проиллюстрированный на рис. 9.20, довольно прост. По получаемым результатам конфокальная микроскопия значительно превосходит обычнуюГлава 9. Визуализация клеток 1027Рис. 9.19. Обращенная свертка изображения. (а) Световая микрофотография крупной политеннойхромосомы Drosophila, окрашенной ДНК-связывающим флуоресцентным красителем. (б) После обращенной свертки изображения становится видна полосатость хромосом. Каждая полоса имеет ширинуоколо 0,25 мкм, что близко к разрешающей способности микроскопа.
(С любезного разрешения JohnSedat Laboratory.)оптическую микроскопию (рис. 9.21).Обычно в микроскопе используют флуоресцентную оптику (смотри рис. 9.13),но, вместо того чтобы освещать весь образец одновременно, как это обычно делается,оптическая система в каждый момент времени фокусирует пятно света на единственной точке на определенной глубине образца. Для этого требуется очень яркийточечный источник света; обычно используют лазер, пучок которого пропускаютчерез диафрагму очень малого диаметра.
Испускаемую освещаемым веществомфлуоресценцию собирают и переносят на изображение при помощи подходящегодетектора света. Перед детектором устанавливают диафрагму с точечным отверстиемв конфокальном положении по отношению к диафрагме лазера, то есть лучи, испускаемые освещенной точкой образца, находятся точно в фокусе. Таким образом,свет от этой точки препарата сходится на диафрагме и идет на детектор.С другой стороны, свет от областей вне фокальной плоскости освещения также находится не в фокусе точечной диафрагмы и, следовательно, большей частьюотрезается от детектора (см. рис.
9.20). Для построения двумерного изображенияпоследовательно считывают данные с каждой точки фокальной плоскости путемрастрового сканирования всей плоскости (как на экране телевизора). Изображениевыводится на видеоэкран. На рис 9.20 не показано, что сканирование обычно производится путем отражения луча колеблющимся зеркалом, расположенным междудихроичным зеркалом и линзой объектива так, чтобы освещающий пучок лазераи конфокальная диафрагма находились строго в одном регистре.Конфокальный микроскоп позволил расшифровать структуры множествасложных трехмерных объектов (рис. 9.22), включая сети волокон цитоскелетав цитоплазме и распределение хромосом и генов в ядре.Сравнительная ценность методов обращенной свертки и конфокальной микроскопии для трехмерной оптической микроскопии все еще остается под вопросом.1028Часть III.
МетодыРис. 9.20. Конфокальный флуоресцентный микроскоп. На данной упрощенной схеме видно, что расположение оптических составляющих сходно со стандартным флуоресцентным микроскопом, изображеннымна рисунке 9.13. Основное отличие состоит в том, что для освещения диафрагмы с точечным отверстием,чье изображение фокусируется на единственной точке образца, используется лазер (а). Испущеннаяданной точкой образца флуоресценция фокусируется на второй (конфокальной) диафрагме (б).
Свет,испускаемый другими областями образца, не фокусируется на диафрагме и, следовательно, не вноситвклада в конечное изображение (в). Путем сканирования образца лучом лазера строится очень четкоедвумерное изображение фокальной плоскости, не нарушаемое светом других областей препарата.Конфокальные микроскопы в общем случае проще в использовании, чем системыобращенной свертки, и конечные оптические срезы можно быстро увидеть. С другой стороны, охлажденные камеры с ПЗС (приборами с зарядовой связью), применяемые в системах обращенной свертки, очень эффективно собирают свет малойинтенсивности, и их можно использовать для создания подробных трехмерныхизображений слабоокрашенных или легко повреждаемых светом конфокальногомикроскопа препаратов.Оба метода, однако, имеют еще один недостаток: они плохо работают с толстыми образцами. Методы обращенной свертки быстро становятся неэффективнымина глубине препарата, большей чем 40 мкм, тогда как конфокальные микроскопыспособны получать изображения до глубины 150 мкм.
В настоящее время в специальных конфокальных микроскопах используют принцип возбуждения флуоресцентных молекул для проникновения глубже в образец. Обычно флуоресцентныемолекулы возбуждаются единственным высокоэнергетическим фотоном, длинаволны которого меньше, чем испускаемый свет, но их можно дополнительно возбудить поглощением двух (или более) фотонов меньшей энергии при условии, что ониГлава 9. Визуализация клеток 1029Рис. 9.21. Сравнение традиционной и конфокальной микроскопии. Это две микрофотографии одногои того же зародыша Drosophila на стадии гаструлы, окрашенного флуоресцентным зондом к актиновымфиламентам.
(а) Обычное, необработанное изображение размыто из-за присутствия флуоресцирующихструктур ниже и выше фокальной плоскости. (б) На конфокальном изображении эта расфокусированнаяинформация удаляется, и получается четкий оптический срез клеток зародыша. (С любезного разрешенияRichard Warn и Peter Shaw.)достигают молекулы за фемтосекунду или меньше.
Применение такого возбуждениябольшей длиной волны несет несколько важных преимуществ. Помимо сниженияфонового шума, красный или почти инфракрасный свет способен проникать глубжев образец. Мультифотонные конфокальные микроскопы, сконструированные с использованием такого «двухфотонного» эффекта, обычно способны давать четкиеизображения даже на глубине образца 0,5 мм.
Это особенно ценно при изученииживых тканей, например, для визуализации динамической активности синапсови нейронов вблизи поверхности живого мозга (рис. 9.23).Рис. 9.22. Трехмерная реконструкция изображений конфокального микроскопа. Пыльца, в данномслучае страстоцвета, обладает сложной скульптурированной клеточной стенкой, содержащей флуоресцентные соединения.
Изображения, полученные на разной глубине пыльцевого зерна, могут бытьобъединены для получения трехмерной структуры целой пылинки (показана справа). Три отдельныхоптических среза из полного набора из 30, на каждом из которых почти не видно вклада соседних срезов,показаны слева. (С любезного разрешения Brad Amos.)1030Часть III. МетодыРис. 9.23. Мультифотонное получение изображений.
Инфракрасный свет обладает меньшим повреждающим действием на живые клетки и способен проникать глубже в живые ткани. Двухфотонный эффект,при котором флуорохром может быть возбужден при одновременном поглощении двух инфракрасныхфотонов вместо единственного высокоэнергетического фотона, позволяет нам видеть на глубину 0,5 ммвнутрь коры живого головного мозга мыши. Краситель, флуоресценция которого изменяется в зависимости от концентрации кальция, позволяет увидеть изменяющиеся во времени активные синапсы(желтые) на дендритных шипиках (красные). (С любезного разрешения Karel Svoboda.)9.1.9. Флуоресцентные белки можно использовать для маркирования отдельных белков в живых клетках и организмахДаже наиболее стабильные клеточные структуры должны быть собраны, разобраны и преобразованы в течение жизненного цикла клетки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
