Часть 3 (1129751), страница 35
Текст из файла (страница 35)
Другие структуры,часто огромного размера в молекулярном масштабе, быстро изменяются, движутсяи перестраивают себя по мере того, как клетка управляет своими внутреннимипроцессами и реагирует на окружающую среду. Сложные, высокоорганизованныеэлементы молекулярного аппарата перемещают компоненты по клетке, контролируядвижение внутрь ядра и из него, из одной органеллы в другую и в саму клеткуи из нее.Разработано несколько методов, позволяющих сделать определенные компоненты живых клеток видимыми в микроскоп.
Большинство этих подходов включаетв себя использование флуоресцентных белков, и они требуют компромисса междусохранностью структуры и эффективным мечением. Все описанные выше флуоресцентные молекулы синтезируются вне клетки и затем искусственно вводятся в нее.Сейчас, после обнаружения генов, кодирующих по своей природе флуоресцентныемолекулы белков, открыты новые возможности.
Генная инженерия теперь позволяетсоздавать клеточные линии или организмы, синтезирующие свои собственные видимые маркеры и метки без введения чужеродных молекул. Такие клетки выставляютнапоказ свое внутреннее устройство в ярком флуоресцентном свете.Главным среди флуоресцентных белков, используемых для этих целей, являетсязеленый флуоресцентный белок (Green Fluorescent Protein, GFP), выделенныйиз медузы Aequoria victoria. Этот белок в норме кодируется единственным геном,который можно клонировать и ввести в клетки других организмов. Синтезированныйбелок сначала не флуоресцирует, но где-то через час (больше или меньше в случаенекоторых аллелей генов) он претерпевает автокаталитические посттрансляционныемодификации для формирования эффективного и яркого флуоресцирующего центра,окруженного внутренним объемом бочкообразного белка (рис. 9.24).
Интенсивныйсайт-специфический мутагенез последовательности исходного гена привел к получению полезной флуоресценции в разнообразных организмах — от животныхи растений до грибов и микробов. Также улучшена эффективность флуоресценциии созданы альтернативные формы белка, отличающиеся по спектрам поглощенияГлава 9. Визуализация клеток 1031Рис. 9.24. Зеленый флуоресцентный белок (GFP). На схематически изображенной здесь структуре GFP хорошо видны одиннадцать β-листов, образующих стенки «бочки». Внутри «бочки»расположен активный хромофор (темно-зеленый), которыйформируется посттрансляционно из выступающих боковых цепей трех аминокислотных остатков.
(Адаптировано из M. Ormöet al., Science 273: 1392–1395, 1996. С любезного разрешенияиздательства AAAS.)и испускания в сине-зелено-желтых пределах. Недавно открытое в кораллах родственное семействофлуоресцентных белков позволило использоватькрасную область спектра (смотри рис. 9.14).Одно из самых простых применений GFPявляется его использование в качестве репортерноймолекулы – флуоресцентного зонда для наблюдения экспрессии генов.
Можно создать трансгенныйорганизм, у которого GFP-кодирующая последовательность будет находиться под транскрипционнымконтролем промотора интересующего гена. Это позволяет напрямую наблюдать профиль экспрессиигенов в живом организме (рис. 9.25). Другое применение — присоединение к GFPсигнального пептида для направления его в определенный компартмент клетки, например, эндоплазматический ретикулум или митохондрию. В результате органеллаосвещается, и можно наблюдать ее в живомсостоянии (см.
рис. 12.35, б).Кодирующую последовательность ДНКGFP также можно вставить в начало иликонец гена другого белка, что приводит к синтезу химерного продукта, состоящего из этогобелка и присоединенного к нему GFP-домена.Во многих случаях такой химерный белокс GFP ведет себя так же, как и исходныйбелок, напрямую указывая на его положеРис. 9.25. Использование зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве репортера.
В данном эксперименте, проводившемся на фруктовой мушке, генGFP присоединяли (методом рекомбинантных ДНК) кмушиному промотору, активному только в определенном наборе нейронов. Данное изображение живогоэмбриона мушки было получено при помощи флуоресцентного микроскопа. На фотографии видны примерно20 нейронов, из каждого выходят длинные отростки(аксоны и дендриты), сообщающиеся с другими (нефлуоресцирующими) клетками. Эти нейроны расположеныпрямо под поверхностью животного и позволяют емучувствовать его ближайшее окружение. (W. B. Grueberet al., Curr.
Biol. 13: 618–626, 2003. С любезного разрешения Elsevier.)1032Часть III. МетодыРис. 9.26. Белки, меченные GFP. (а) Верхняя поверхность листьев растения Arabidopsis покрыта огромными разветвленными одноклеточными волосками, выступающими над плоскостью эпидермиса. Этиволоски, или трихомы, можно увидеть в сканирующем электронном микроскопе. (б) Если Arabidopsisтрансформировать последовательностью ДНК, кодирующей талин (актин-связывающий белок) и сшитойс кодирующей последовательностью GFP, синтезируемый флуоресцентный белок талин связывает актиновые филаменты во всех живых клетках трансгенного растения.
Конфокальная микроскопия позволяетнаблюдать динамику всего актинового цитоскелета трихомы (зеленый). Красная флуоресценция исходитот хлорофилла клеток листа, лежащих под эпидермисом. (С любезного разрешения Paul Linstead (а)и Jaideep Mathur (б).)ние и функционирование, благодаря генетически закодированному окрашиванию(рис.
9.26). Часто можно доказать, что химерный белок с GFP функциональноэквивалентен немеченому белку; например, можно использовать его для спасениямутанта, у которого исходный белок отсутствует. Мечение GFP является наиболеепрозрачным и однозначным способом показать распределение и динамику белкав живом организме (рис. 9.27).Рис. 9.27.
Динамика мечения GFP. На данной последовательности микрофотографий показан набортрехмерных изображений живого ядра, полученных в течение часа. Клетки табака были стабильнотрансформированы GFP, сшитым с белком сплайсосом, концентрирующимся в маленьких ядерныхтельцах — тельцах Кахаля (см. рис. 6.48). Флуоресцирующие тельца Кахаля, хорошо видимые в живойклетке при помощи конфокальной микроскопии, — динамические структуры, передвигающиеся по ядру.(С любезного разрешения Kurt Boudonck, Liam Dolan и Peter Shaw.)Глава 9.
Визуализация клеток 10339.1.10. Динамику белков можно наблюдать в живых клеткахВ настоящее время флуоресцентные белки используют не только для локализации определенного белка в клетке, но и для изучения его кинетических свойстви взаимодействия с другими белками. Здесь мы опишем три метода, в которыхGFP и родственные ему белки используют для этих целей.Первый метод — это наблюдение за взаимодействием одного белка с другимпри помощи резонансного переноса энергии флуоресценции (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET). В данном подходе, принцип которого описан выше(см. рис.
8.26), две интересующие молекулы метят разными флуорохромами, подобранными таким образом, чтобы спектр испускания одного из них перекрывалсясо спектром поглощения другого. Если два белка связываются друг с другом и ихфлуорохромы сближаются на расстояние меньше 5 нм, один флуорохром переноситэнергию поглощенного света на другой.
Таким образом, когда комплекс освещаютсветом длины волны возбуждения первого флуорохрома, регистрируемая флуоресценция будет иметь длину волны испускания второго флуорохрома. В данномметоде в качестве флуорохромов можно использовать две различные спектральныеформы GFP и наблюдать такие процессы, как взаимодействие сигнальных молекулс рецепторами или белков в макромолекулярных комплексах (рис.
9.28).Высокая организация и быстрота многих внутриклеточных процессов, например действия сигнальных молекул или движения белков цитоскелета, усложняютих изучение на уровне единственной клетки. В идеале мы хотим вводить в живуюклетку любую интересующую молекулу в точно заданный момент времени и в точно заданном положении и следить за последующим поведением и ответом клеткина эту молекулу.
Микроинъекции не позволяют точно контролировать место и время доставки молекулы. Более эффективный подход — синтез неактивной формыинтересующей флуоресцентной молекулы, введение ее в клетку и внезапная активация в выбранном клеточном сайте путем фокусирования на нем луча света. Этотпроцесс называют фотоактивацией. Такого рода неактивные светочувствительныемолекулярные предшественники, часто называемые «запертыми» молекулами,сконструированы для многих флуорохромов. Для фокусировки интенсивного пучкасвета лазера на мельчайшей области клетки можно использовать микроскоп, такчто экспериментатор способен контролировать, где и когда будет фотоактивированафлуоресцентная молекула.Один из классов «запертых» флуоресцентных белков получают путем присоединения фотоактивируемого флуоресцентного маркера к очищенному белку.Важно, чтобы модифицированный белок оставался биологически активным: мечение«запертым» флуоресцентным красителем добавляет на поверхность белка объемнуюгруппу, которая легко может изменить свойства белка.
Удовлетворительный протоколмечения обычно составляется путем проб и ошибок. Как только биологически активный меченый белок синтезирован, его необходимо ввести в клетку (см. рис. 9.34),где можно наблюдать за его поведением. Например, меченный «запертым» флуоресцеином тубулин при введении в делящуюся клетку может встраиваться в микротрубочки митотического веретена деления. Когда небольшой участок веретена деленияосвещают лазером, меченый тубулин начинает флуоресцировать, что позволяетс легкостью следить за его движением вдоль микротрубочек (рис.
9.29).Метод фотоактивации усовершенствован после открытия того факта, что гены,кодирующие GFP и родственные флуоресцентные белки, могут быть мутированы1034Часть III. МетодыРис. 9.28. Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET). Данный эксперимент показывает, чтобелок Sla1p может плотно взаимодействовать с белком Abp1p, участвующим в присоединении кортикального актина к поверхности клеток почкующихся дрожжей. Sla1p экспрессируется в дрожжевойклетке (а) в качестве химерного белка с желтым производным GFP (YFP).
Abp1p экспрессируется в качестве химерного белка (б) с голубой формой GFP (CFP). Сигнал FRET (см. также рис. 8.26), показанныйздесь красным (в), получается путем возбуждения CFP, но регистрации флуоресценцииYFP, котораябудет испускаться, только если два белка находятся близко друг к другу (на расстоянии меньше 0,5 нм).Накортексе (г) после объединения (а), (б) и (в) видны три типа пятен: пятна одиночного Sla1p (стрелкина а), пятна одиночного Abp1p (стрелка на б) и пятна дающего сигнал FRET комплекса этих белков, ложноокрашенное и скорректированное изображение которого показано на (д). Поскольку уже известно,что Sla1p участвует в формировании клеточных включений, данный эксперимент физически связал этотпроцесс с процессом присоединения актина к клеточному кортексу. (Из D. T. Warren et al., J.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
