Часть 3 (1129751), страница 31
Текст из файла (страница 31)
В конце XIX века изготовители микроскопов достигли такогоразрешения, и оно редко встречается в современных, производимых на заводахмикроскопах. Несмотря на то что всегда можно увеличить изображение настолько,насколько мы этого хотим, например, проецируя его на экран, в световой микро-1014Часть III. МетодыРис. 9.4. Интерференция световых волн. Когда две световые волны совпадают по фазе, амплитудаи яркость результирующей волны возрастают.
Две волны света, находящиеся в противофазе, частичнонейтрализуют друг друга и дают волну, амплитуда и, следовательно, яркость которой меньше, чему двух исходных волн.скоп невозможно разрешить два объекта, находящихся на расстоянии меньшем чем0,2 мкм; они будут видны как один объект. Обратите внимание на различие междуразрешением, о котором мы говорили выше, и регистрацией. Если небольшойобъект, размеры которого меньше, чем предел разрешения, сам по себе испускаетсвет, то мы можем его увидеть или зарегистрировать.
Таким образом, мы способныРис. 9.5. Изображения границы и точечного источника света. (а) Интерференционные полосы, видимыепри большом увеличении, когда свет определенной длины волны проходит мимо границы твердогообъекта, находящегося между источником света и наблюдателем. (б) Изображение точечного источникасвета. За счет дифракции мы видим сложную картину концентрических окружностей, ширина которыхзависит от числовой апертуры оптической системы: чем меньше апертура, тем больше (более размыта)дифракционная картина.
Два точечных источника могут быть разрешены, только если центр первоголежит на первом темном кольце второго: так определяют предел разрешения.Глава 9. Визуализация клеток 1015Рис. 9.6. Числовая апертура. Траектория световых лучей, проходящих через прозрачный образец в микроскопе, иллюстрирует понятие числовой апертуры и ее соотношения с пределом разрешения.наблюдать единственную флуоресцентно меченую микротрубочку, хотя ее толщина примерно в десять раз меньше, чем предел разрешения светового микроскопа.Явление дифракции, однако, приведет к тому, что она будет выглядеть размытой,а ее толщина будет составлять по крайней мере 0,2 мкм (см.
рис. 9.17). Благодаряяркому свету, испускаемому звездами, мы способны видеть их в ночном небе, хотяих размер гораздо меньше углового разрешения невооруженного глаза. Они всекажутся одинаковыми точками света, различаясь только по цвету или яркости.При помощи чувствительных методов обнаружения мы можем регистрироватьи следить в световом микроскопе за поведением единственной флуоресцирующейбелковой молекулы.Далее мы увидим, как можно использовать интерференцию и дифракциюдля изучения живых неокрашенных клеток.9.1.2. Живые клетки хорошо видны в фазово-контрастном или дифференциальном интерференционном контрастном микроскопеВ микроскопии всегда существует вероятность потери или нарушения некоторых компонентов клетки в процессе приготовления препарата. Единственнымспособом избежать этого является исследование клеток, когда они еще живы,1016Часть III.
Методыбез фиксации или заморозки. Для этого используют световые микроскопы со специальными оптическими системами.Когда свет проходит через живую клетку, фаза световой волны меняется в соответствии с показателем преломления клетки: относительно толстая или плотнаячасть клетки, например ядро, затормаживает проходящий через нее свет.
Следовательно, фаза волны сдвигается относительно фазы света, прошедшего черезприлегающий более тонкий слой цитоплазмы. В фазово-контрастных микроскопахи более сложных дифференциальных интерференционных контрастных микроскопах используется явление интерференции, происходящей при соединении этихдвух наборов волн и, следовательно, формировании изображения структуры клетки(рис. 9.7). Оба типа световой микроскопии широко применяют для визуализацииживых клеток.Более простой способ увидеть некоторые свойства живых клеток — наблюдение света, рассеянного их различными компонентами.
В темнопольном микроскопе лучи источника света направлены сбоку, поэтому на линзы микроскопапопадают только рассеянные лучи. Таким образом, клетка выглядит как светлыйобъект на темном фоне. В обычном светлопольном микроскопе свет, проходящийчерез клетку в культуре, формирует изображение напрямую. На рис. 9.8 показаносравнение изображений одной и той же клетки, полученных четырьмя методамисветовой микроскопии.Фазово-контрастная, дифференциальная интерференционная контрастнаяи темнопольная микроскопия делают возможным наблюдение движений, происходящих при таких процессах, как митоз и миграция клеток. Поскольку обычноклеточное движение происходит слишком медленно, для того чтобы за ним можноРис. 9.7. Два способа получения контрастного изображения в световой микроскопии. (а) Окрашеннаячасть клетки будет поглощать свет некоторых длин волн, в зависимости от красителя, но остальные длины волн будут проходить через нее.
Таким образом, получается цветное изображение клетки, видимоев обычный светлопольный микроскоп. (б) Амплитуда света, проходящего через неокрашенную живуюклетку, почти не меняется, поэтому даже при очень большом увеличении невозможно рассмотреть подробности структуры. Фаза света, однако, изменяется за счет прохождения луча через более толстые илиплотные участки клетки. При помощи интерференции в фазово-контрастном или дифференциальном интерференционном контрастном микроскопе можно сделать видимыми небольшие изменения фазы.Глава 9. Визуализация клеток 1017Рис.
9.8. Четыре вида световой микроскопии. Показаны четыре изображения одной и той же клеткифибробласта в культуре. Все изображения можно получить в большинстве современных микроскоповс взаимозаменяемыми компонентами оптической системы. (а) Светлопольная микроскопия. (б) Фазовоконтрастная микроскопия. (в) Дифференциальная интерференционная контрастная микроскопия Номарского. (г) Темнопольная микроскопия.было следить в реальном времени, часто удобно использовать съемку в замедленномвремени.
В данном случае камера снимает последовательные кадры, разделенныекороткими промежутками времени, поэтому на полученном в результате наборе изображений, показанном на нормальной скорости, события кажутся ускоренными.9.1.3. Изображения можно увеличивать и анализировать цифровыми методамиВ последние годы электронные, или цифровые, системы построения изображений и связанные с ними методы обработки изображений в значительнойстепени повлияли на световую микроскопию. Преодолены определенные практические ограничения микроскопов, связанные с несовершенством оптических систем.Электронные системы построения изображений также позволили обойти два фундаментальных ограничения человеческого глаза: глаз не способен видеть при оченьтусклом свете и он не может воспринимать небольшие различия в интенсивностисвета на ярком фоне.
Для усиления нашей способности видеть клетки в условияхслабого освещения мы можем присоединить к микроскопу чувствительную цифровую видеокамеру. Такие камеры содержат прибор с зарядовой связью (ПЗС),похожий на устройства в обычных цифровых камерах. Такие камеры с ПЗС частоохлаждают для уменьшения шума изображения. После этого становится возможнымпродолжительное время наблюдать клетки при очень маленькой интенсивности света,которая позволяет избежать разрушительного действия яркого света (и повышеннойтемпературы).
Такого рода камеры слабой освещенности особенно полезны для наблюдения флуоресцентных молекул в живых клетках, как описано ниже.Поскольку полученные при помощи камер с ПЗС изображения сохраняютв электронной форме, их легко оцифровать, ввести в компьютер и обработать различными способами для извлечения скрытой информации. Такая обработка изображенийкомпенсирует различные оптические недостатки микроскопов и позволяет получитьтеоретически возможный предел разрешения. Более того, при помощи цифровой1018Часть III. Методыобработки изображений можно значительно увеличить контрастность и преодолетьограничения глаза, не позволяющие различить небольшие отклонения интенсивностисвета. Несмотря на то что такая обработка также усиливает эффекты случайныхфоновых неровностей оптической системы, цифровое вычитание изображенияпустой области решает и эту проблему.
Этот метод позволяет увидеть маленькиепрозрачные объекты, которые ранее было невозможно отличить от фона.Высокая контрастность, достигаемая компьютерной дифференциальной интерференционной контрастной микроскопией, позволяет увидеть такие маленькиеобъекты, как отдельные микротрубочки (рис. 9.9), диаметр которых составляет0,025 мкм, что меньше чем одна десятая длины волны света. Отдельные микротрубочки, если они флуоресцентно мечены, также можно увидеть в флуоресцентныймикроскоп (см. рис. 9.15). В обоих случаях, однако, неизбежные дифракционныеэффекты размывают изображение, поэтому кажется, что ширина микротрубочексоставляет по крайней мере 0,2 мкм, и становится невозможным отличить однумикротрубочку от скопления нескольких.9.1.4. Обычно перед микроскопией интактные ткани фиксируюти изготавливают их срезыПоскольку толщина большинства образцов тканей слишком велика, чтобынапрямую исследовать отдельные клетки при большом увеличении, их необходимонарезать на очень тонкие прозрачные слои, или срезы.
Чтобы сначала иммобилизовать, убить и сохранить клетки в ткани, их нужно обработать фиксатором. Наиболее распространенные фиксаторы — формальдегид и глутаральдегид, которыеобразуют ковалентные связи со свободными аминокислотными группами белкови сшивают их друг с другом, стабилизируя и закрепляя их положение.Рис. 9.9. Обработка изображений.
(а) Показано необработанное цифровое изображение неокрашенных микротрубочек, полученное при помощи дифференциальной интерференционной контрастноймикроскопии. (б) Изображение обработали, во-первых, путем цифрового вычитания неравномерноосвещенного фона, во-вторых, путем цифрового увеличения контрастности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
