Часть 3 (1129751), страница 26
Текст из файла (страница 26)
Такие коллекции станут незаменимым источником информации о функционировании генов в масштабе генома. В некоторых случаях отдельные мутациив библиотеке будут экспрессировать индивидуальные молекулярные маркерыв форме уникальных последовательностей ДНК, что сделает идентификацию измененного гена простой и быстрой.В S.
cerevisiae задача создания полного набора из 6 000 мутантов, в каждомиз которых отсутствует только один ген, упрощается благодаря склонности дрожжейк гомологичной рекомбинации. Для каждого гена готовят «кассету делеции». Кассетасостоит из специальной молекулы ДНК, окружающей селективный маркер и содержащей 50 нуклеотидов, последовательность которых идентична концам гена-мишени.Более того, для ускорения последующей идентификации каждой полученной мутантной линии в эту молекулу ДНК вставляют специальную последовательность«штрих-код» (рис.
8.68). Затем в различных селективных условиях (например,ограничение по питательным веществам, перепады температуры или присутствиеразличных лекарств) можно вырастить большое число таких нокаутных мутантов.Выжившие клетки легко идентифицируются по своим уникальным маркернымпоследовательностям. С того, насколько хорошо себя чувствует каждый мутантв смеси, можно начать оценивать, какие гены являются жизненно важными, какиепросто полезными, а какие необязательными для роста в различных условиях.Сложность получения информации из такого исследования мутантов дрожжейсостоит в определении на основе мутантного фенотипа активности гена или егобиологической роли. Некоторые дефекты — неспособность жить без гистидина,например, — напрямую указывают на функцию гена дикого типа.
Другие связиРис. 8.68. Создание коллекций мутантных организмов. (а) Кассета делеции для использования в дрожжах содержит последовательности ДНК (красные),гомологичные каждому концу гена-мишени X, селективный маркерный ген (синий) и уникальную последовательность-«штрих-код» длиной примернов 20 п. н. (зеленая). Эту ДНК затем вводят в клетки дрожжей, где она заменяет ген-мишень путем гомологичной рекомбинации. Используя набор такихкассет, каждая из которых специфична по отношению к одному определенному гену, можно создать библиотеку мутантов дрожжей, содержащую поодному мутанту для каждого гена. (б) Сходный подход можно применять для приготовления маркированных нокаутных мутантов Arabidopsis и Drosophila.
В данном случае мутации создают случайной вставкой мобильного генетического элемента в ген-мишень. Затем собирают всю ДНК полученногоорганизма и проверяют ее на нарушение интересующего гена при помощи праймеров ПЦР, связывающихся с мобильным элементом и геном-мишенью.Продукт ПЦР можно обнаружить в геле, только если мобильный генетический элемент встроился в ген-мишень (см. рис.
8.45).994Часть III. МетодыГлава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 995могут быть не настолько очевидными. Что может сказать внезапная чувствительность к холоду о роли определенного гена в дрожжевой клетке? Эти проблемы ещеусложняются в более высокоразвитых организмах, чем дрожжи. Потеря функцииединственного гена мыши, например, может повлиять на различные типы тканейна разных стадиях развития, тогда как удаление других генов может не иметьникакого видимого эффекта. Адекватное описание мутантных фенотипов мышейчасто требует подробного исследования, основанного на глубоком знании анатомии,гистологии, патологии, физиологии и этологии этих животных.Однако информация, которую может дать анализ библиотек мутантов, будетполезна.
Например, изучение исчерпывающей коллекции мутантов Mycoplasmagenitalium, организма с самым маленьким известным геномом, дало нам минимальный набор генов, необходимый для клеточной жизни. Анализ мутантов показал,что для роста в лабораторных условиях M. genitalium требуется примерно тричетверти его 480 кодирующих белки генов. Функции примерно 100 из этих жизненно необходимых генов неизвестны. Это говорит о том, что нам предстоит открытьеще удивительно большое количество фундаментальных клеточных механизмов,лежащих в основе жизни.8.5.16. РНК-интерференция — это простой и быстрый способанализа функции генаНесмотря на то что нокаут генов и изучение последствий является, возможно,наиболее эффективным методом исследования функций генов, недавно был открытзначительно более простой способ инактивации генов. Метод РНК-интерференции(или, сокращенно, RNAi) основан на естественном механизме, используемом многими растениями, животными, грибами и простейшими для защиты от определенных вирусов и мобильных генетических элементов (см.
рис. 7.115). В клетку илиорганизм вводят двухцепочечную молекулу РНК (дцРНК), последовательностькоторой комплементарна части гена, который необходимо инактивировать. После процессинга дцРНК, осуществляемого специальным комплексом белков, онагибридизуется с мРНК гена-мишени и приводит к ее деградации. Затем клеткаиспользует небольшие фрагменты этой деградированной РНК для синтеза новыхдцРНК, которые продолжают уничтожать мРНК гена-мишени. Поскольку этикороткие фрагменты РНК могут передаваться клеткам-потомкам, РНКи способнавызывать наследственные изменения экспрессии генов. Но, как мы видели в главе 7,существует второй механизм, благодаря которому РНКи может стабильно инактивировать гены.
Образовавшиеся в цитозоле в результате деградации фрагментыРНК могут проникать в ядро и напрямую взаимодействовать с геном-мишенью,направляя его упаковку в недоступную для транскрипции форму хроматина. Такойдвойной режим регуляции экспрессии генов делает РНК-интерференцию крайнеэффективным инструментом отключения генов одного за другим.РНКи часто используют для инактивации генов в Drosophila и культурахклеточных линий млекопитающих. В самом деле, набор из 15 тысяч молекул интерферирующих РНК Drosophila (по одной на каждый ген) позволяет исследователям за несколько месяцев проанализировать роль каждого гена мушки в любомпроцессе, который можно наблюдать в культуре клеток.
Скоро станет возможнымпроводить такой анализ с 25 тыс. мышиных и человеческих генов. РНКи такжешироко используют для изучения функционирования генов нематоды C. elegans.При работе с червями вводить дцРНК довольно просто: РНК можно напрямую996Часть III. Методывпрыскивать в кишечник животного или кормить его модифицированной E.
coli,синтезирующей нужную интерферирующую РНК (рис. 8.69). РНК распределяетсяпо всему телу червя, где она ингибирует экспрессию гена-мишени в различных типахткани. Поскольку геном C. elegans полностью расшифрован, РНКи применяютдля присваивания функций всему набору генов червя.В последнее время родственный метод стали широко применять к мышам.В данном случае для введения интерферирующих РНК не используют инъекциюили корм. Для создания трансгенных мышей, экспрессирующих интерферирующуюРНК под контролем индуцируемого промотора, применяют методы рекомбинантныхДНК. Часто это специально сконструированная РНК, способная замыкаться самана себя и за счет спаривания нуклеотидов образовывать двухцепочечный участок,узнаваемый аппаратом.
В результате инактивируются только те гены, последовательность которых точно совпадает с последовательностью интерферирующей РНК.В зависимости от типа индуцируемого промотора интерферирующая РНК можетсинтезироваться только в определенной ткани или в конкретный момент развития,что позволяет тщательнее исследовать функции генов.РНК интерферирующей РНК сделала обратную генетику многих организмовпростой и эффективной, но она обладает несколькими потенциальными ограничениями, отсутствующими у настоящего нокаута генов.
По неизвестным причинам РНКинтерференция неэффективно работает для некоторых генов. Более того, в пределах целого организма некоторые ткани могут быть устойчивыми к действию RNAi(например, нейроны круглых червей). Другая проблема состоит в том, что многиеорганизмы содержат большие семейства генов, члены которых обладают сходнымипоследовательностями. В результате, РНКи иногда инактивирует наравне с геноммишенью родственные гены. Избежать таких эффектов можно, используя большоечисло интерферирующих РНК, комплементарных различным участкам одного и тогоже гена. Результаты любого эксперимента по РНКи должны рассматриваться каксерьезный аргумент в пользу функции гена, но он не является ее доказательством.Рис.
8.69. Создание доминантно-негативной мутации методом РНКинтерференции. (а) Двухцепочечная РНК (дцРНК) может быть введена в C. elegans (1) путем кормления червей E. coli, экспрессирующейдцРНК, или (2) путем инъекции дцРНК напрямую в кишечник. (б) Эмбрион червя дикого типа вскоре после оплодотворения яйцеклетки.Пронуклеусы яйцеклетки и сперматозоида (красные стрелки) мигрируют и сближаются в задней половине зародыша.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
