Часть 3 (1129751), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Например, разработан оченьэлегантный метод скрининга для поиска генов, участвующих в обработке зрительнойинформации у рыб данио. В основе этого скрининга, который отслеживает ответрыб на движение, лежит изменение поведения. Рыбы дикого типа плывут в направлении воспринятого движения, тогда как мутанты с нарушениями в системахобработки зрительной информации плавают в случайных направлениях — такоеповедение легко выделить. Одним из мутантов, обнаруженных при таком скрининге,является lakritz, у которого отсутствует 80 % клеток ганглия сетчатки, помогающихпередавать зрительные сигналы от глаз в мозг.
Поскольку клеточная организациясетчатки рыб данио сходна с таковой всех позвоночных, изучение таких мутантовдолжно способствовать пониманию принципов обработки зрительной информацииу людей.Поскольку дефекты генов, необходимых для фундаментальных клеточныхпроцессов, например синтеза и процессинга РНК или регуляции клеточного цикла, часто являются летальными, функции этих генов обычно исследуют на особяхс условными мутациями. Мутантные особи нормально функционируют до техпор, пока они находятся в «пермиссивных» (от англ.
permissive — разрешающий)условиях. Но как только они подвергаются воздействию «рестриктивных» (от англ.restrictive — ограничительный) условий, проявляется нарушение функционирования гена. Например, в организмах с температурочувствительными мутациямиможно включать и выключать проявление нарушения, просто меняя температуру;таким образом, клетка, содержащая температурочувствительную мутацию в гене,необходимом для выживания, погибнет при рестриктивной температуре, но будетнормально размножаться при пермиссивной (рис.
8.55). Температурочувствительныйген в такой особи обычно содержит точечную мутацию, вызывающую небольшоеизменение его белкового продукта.В бактериальных генах, кодирующих необходимые для репликации ДНКбелки, найдено множество температурочувствительных мутаций. Мутанты обна-Рис. 8.55. Скрининг на температуро-чувствительных мутантов бактерий или дрожжей. Обработанныемутагеном клетки растут при пермиссивной температуре. Они делятся и образуют колонии, которыеметодом отпечатков переносят на две одинаковые чашки Петри.
Одну из этих чашек инкубируют при пермиссивной температуре, вторую — при рестриктивной. Клетки, содержащие температурочувствительнуюмутацию в гене, необходимом для пролиферации, могут делиться при нормальной, пермиссивнойтемпературе, но не могут при рестриктивной (в данном случае, повышенной).976Часть III.
Методыружили при скрининге подвергнутых действию мутагенов популяций бактерийна наличие клеток, которые перестают синтезировать ДНК при нагреванииот 30° C до 42° C. Эти мутанты впоследствии использовали для идентификациии описания соответствующих белков репликации ДНК (см. главу 5). Аналогично, скрининг на температурочувствительные мутации привел к идентификациимногих белков, участвующих в регуляции клеточного цикла, а также множествабелков, отвечающих за движение пептидов через секреторный путь дрожжей(см.
приложение 13.1). Родственные подходы скрининга позволили определитьфункции ферментов, принимающих участие в принципиальных метаболическихпутях бактерий и дрожжей (этот вопрос рассмотрен в главе 2), а также идентифицировать продукты генов, ответственных за правильное развитие зародышейDrosophila (см. главу 22).8.5.3. Мутации могут привести к потере или приобретению белкомфункцииГенные мутации разделяют на два класса: мутации «с потерей функции» и мутации «с приобретением функции».
Мутации с потерей функции приводят к тому,что продукт гена либо не работает, либо работает слишком слабо; так можно понять,какую функцию выполняет нормальный ген. Мутации с приобретением функцииприводят к тому, что продукт гена либо слишком активен, либо работает в неправильное время и в неправильном месте, либо работает по-другому (рис.
8.56).На начальных этапах генетического анализа любой мутантной клетки илиорганизма важно узнать, вызывает ли мутация потерю или приобретение функции.Стандартный тест состоит в определении того, является ли мутация доминантнойили рецессивной. Доминантная мутация вызывает формирование мутантного фенотипа даже в присутствии нормальной копии гена. Рецессивная мутация не способнавызвать формирование мутантного фенотипа при наличии единственной копии генадикого типа. Несмотря на то что были описаны случаи, когда мутация с потерейфункции была доминантной, а мутация с приобретением функции — рецессивной,в большинстве случаев рецессивные мутации приводят к потере функции, а доминантные — к приобретению.
Определить, является ли мутация рецессивной илиРис. 8.56. Мутации генов, по-разному влияющие на белковые продукты. В данном примере белок дикоготипа обладает в клетке специфической функцией, обозначенной красными лучами. Показаны мутации,которые отключают, усиливают или изменяют функцию при увеличении температуры. Белок с температурочувствительной условной мутацией несет аминокислотную замену (красная), которая препятствуетего правильному фолдингу при 37° C, но позволяет ему нормально сворачиваться и функционироватьпри 25° C. Такие условные мутации особенно полезны для исследования жизненно необходимых генов;для изучения функционирования гена организм можно выращивать в пермиссивных условиях, а затемпереносить в рестриктивные условия.Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 977доминантной, легко.
Нужно просто скрестить мутанта с диким типом и получитьдиплоидные клетки или организмы. Полученное потомство будет гетерозиготнымпо мутации. Если мутантный фенотип в потомстве не найден, можно сделать выводо рецессивности мутации и, скорее всего, она приведет к потере функции.8.5.4. Тесты на комплементацию показывают, расположены ли двемутации в одном гене или в разныхШирокомасштабный генетический скрининг может дать много разных мутаций,проявляющихся в одинаковом фенотипе. Эти дефекты могут быть расположеныв различных генах, функционирующих в одном и том же процессе, или могутбыть разными мутациями одного гена. Альтернативные формы гена называюталлелями. Наиболее распространенное различие между аллелями — замена однойнуклеотидной пары, но различные аллели также могут нести делеции, заменыили дупликации.
Как тогда можно узнать, расположены ли две мутации, дающиеодинаковый фенотип, в одном гене или в разных? Если мутации рецессивны, например, они приводят к потере функции определенного гена, можно провести тестна комплементацию, позволяющий определить, содержатся ли мутации в одномили разных генах. Для тестирования на комплементацию в диплоидном организмегомозиготную по одной мутации особь, обладающую двумя одинаковыми аллелямимутантного гена, скрещивают с особью, гомозиготной по второй мутации.
Если обемутации расположены в одном гене, то потомство будет иметь мутантный фенотип, потому что оно не будет обладать нормальными копиями данного гена (см.приложение 8.1). Если, наоборот, мутации лежат в различных генах, то полученное потомство будет относиться к нормальному фенотипу, потому что оно будетнести одну нормальную копию (и одну мутантную) каждого гена. Таким образоммутации дополняют друг друга и восстанавливают нормальный фенотип. Тест обнаруженных при генетическом скрининге мутантов на комплементацию показал,например, что дрожжам для переваривания сахара галактозы требуется 5 генов,E.
coli для формирования функционирующих ресничек нужно 20 генов, в сборкевирусных частиц бактериофага T4 участвует 48 генов и сотни генов необходимыдля развития из оплодотворенного яйца взрослого круглого червя.8.5.5. Порядок работы генов в метаболическом пути можно определить при помощи эпистазаОбычно следующим шагом после идентификации набора генов, участвующихв определенном биологическом процессе, является определение порядка, в котором этигены функционируют. Порядок генов проще всего объяснить на примере метаболических путей, где, например, фермент A необходим для синтеза субстрата для ферментаB.
В этом случае можно сказать, что в метаболическом пути ген, кодирующий ферментA, работает до гена, кодирующего фермент B. Точно так же в случае, если один белокрегулирует активность другого, мы скажем, что первый ген работает до второго. Порядок генов во многих случаях можно определить просто при помощи генетическогоанализа без каких-либо знаний о механизме действия продуктов генов.Предположим, что у нас есть биосинтетический процесс, состоящий из последовательных этапов, причем выполнение этапа B происходит только послезавершения этапа A. Предположим также, что для этапа A необходим ген A,а для этапа B — ген B. Тогда нуль-мутация (мутация, отключающая функцию)978Часть III.
Методыв гене A остановит процесс на этапе A, вне зависимости от того, функционирует генB или нет. С другой стороны, нуль-мутация в гене B вызовет остановку на этапеB только тогда, когда ген A все еще активен. В таком случае говорят, что ген Aявляется эпистатическим по отношению к гену B. Сравнение фенотипов различных комбинаций мутаций позволяет определить порядок работы генов. Такойанализ называется эпистазом. При помощи эпистаза проанализирован путь секрециибелков у дрожжей.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
