Часть 3 (1129751), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Огромная специфичность такой реакции гибридизациипозволяет пометить любую одноцепочечную последовательность нуклеотидоврадиоизотопом или химическим соединением и использовать ее в качестве зонда для нахождения комплементарной цепи даже в клетке или клеточном экстракте, содержащих миллионы различных последовательностей ДНК и РНК.Такого рода зонды широко применяются для обнаружения нуклеиновых кислот,соответствующих определенным генам, для ускорения их очистки и описанияи определения их расположения в клетках, тканях и организмах.Нуклеотидные последовательности ДНК можно быстро и просто расшифровать при помощи высокоавтоматизированных методов, основанныхна дидезокси-секвенировании ДНК. Это подход позволил определить полныепоследовательности ДНК геномов многих организмов. Сравнение геномных последовательностей различных организмов позволяет отслеживать эволюционныевзаимоотношения между генами и организмами, а также открывать новые геныи предсказывать их функции.Все вместе, эти методы анализа и манипуляции ДНК сделали возможными идентификацию, выделение и секвенирование генов любого интересующегоорганизма.
Соответствующие подходы позволяют ученым получать большиеколичества белковых продуктов этих генов, необходимые для подробного анализа их структуры и функций, а также для медицинских целей.970Часть III. Методы8.5. Изучение экспрессии и функционирования геновВ конечном счете ученые хотят узнать, как гены — и кодируемые ими белки —функционируют в интактном организме.
Хотя это может показаться противоречащимздравому смыслу, но одним из наиболее показательных способов определения того,что делает ген, является наблюдение за тем, что происходит с организмом, еслиген отсутствует. Изучение мутантных организмов, несущих изменения или делециив нуклеотидных последовательностях, является в биологии проверенной временемпрактикой и формирует основу важной области генетики. Поскольку мутациимогут нарушать клеточные процессы, мутанты часто являются ключом к пониманию функции гена. Классический генетический подход начинается с нахождениямутантов, обладающих интересным или необычным внешним видом, например,фруктовых мушек с белыми глазами или изогнутыми крыльями. Работая в обратном направлении от фенотипа — внешнего вида или поведения особи, — можноопределить генотип организма, форму гена, ответственного за эту характеристику(приложение 8.1).Сегодня, когда доступно множество геномных последовательностей, изучениефункции гена часто начинается с последовательности ДНК.
В данном случае задачасостоит в переводе последовательности в функцию. Один из подходов мы описаливыше в этой главе. Он состоит в поиске по базам данных подробно охарактеризованных белков, обладающих подобными продукту нового гена аминокислотнымипоследовательностями. Для дальнейшего исследования функции гена применяютметоды, описанные в предыдущем разделе. Но для того чтобы напрямую определитьфункцию гена в клетке или организме, наиболее эффективным подходом являетсяизучение мутантов, у которых этот ген отсутствует или экспрессируется его измененная версия.
Понимание того, какой клеточный процесс у таких мутантов былнарушен, обычно проливает свет на биологическую роль гена.В данном разделе мы опишем несколько подходов к определению функциигена, начиная с последовательности ДНК или организма с интересным фенотипом.Сперва мы рассмотрим классический генетический подход, который начинаетсяс генетического скрининга для обнаружения интересных мутантов. За этим следуетпроцесс идентификации гена или генов, ответственных за наблюдаемый фенотип.Затем мы опишем набор методов, в совокупности носящих название обратной генетики («от гена к признаку»), в которой исследование для определения функцииначинается с гена или последовательности гена.
Этот подход часто включает в себянекоторое количество разумных предположений в области поиска гомологичныхпоследовательностей и определения того, когда и где ген экспрессируется, а такжесоздание мутантных организмов и описание их фенотипа.8.5.1. Классическая генетика начинается с нарушения клеточногопроцесса путем случайного мутагенезаДо наступления эпохи клонирования генов, большинство генов идентифицировали по отклонениям от нормы, вызванным мутацией гена. Этот классическийгенетический подход — идентификация генов, ответственных за мутантные фенотипы, — проще всего реализуется в случае быстро размножающихся и легко поддающихся генетическим манипуляциям организмов, например бактерий, дрожжей,круглых червей и фруктовых мушек.
Несмотря на то что спонтанные мутации иногдаможно обнаружить при изучении очень больших популяций, состоящих из тысячГлава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 971и десятков тысяч особей, выделение одной мутантной особи более эффективно,если направленно создавать мутации химическими веществами или радиацией,повреждающими ДНК. Подвергая организмы действию такого рода мутагенов,можно очень быстро создать множество мутантных особей, а затем искать срединих определенный вызывающий интерес дефект, как мы скоро обсудим.Альтернативой химическому или радиационному мутагенезу служит инсерционный мутагенез (мутагенез методом микроинъекций). Этот метод основан на томфакте, что экзогенная ДНК при случайном введении в геном может привести к возникновению мутаций, если введенный фрагмент нарушает ген или его регуляторные последовательности.
Введенная ДНК, последовательность которой известна,служит молекулярным маркером, способствующим последующей идентификациии клонированию нарушенного гена (рис. 8.53). В случае Drosophila использованиетранспозона P для инактивации генов совершило переворот в изучении функционирования генов фруктовой мушки.
Мобильные генетические элементы (см. табл. 5.3,стр. 318) также используют для создания мутаций в бактериях, дрожжах, мышахи цветковом растении Arabidopsis.Такого рода классические генетические исследования хорошо подходят для разложения по полочкам биологических процессов в экспериментальных организмах,но как можно изучать функционирование генов в человеке? В отличие от организмов,над которыми легко проводить генетические манипуляции, люди размножаютсямедленно, и их нельзя умышленно подвергать действию мутагенов.
Более того,Рис. 8.53. Инсерционный мутант львиного зева, Antirrhinum. Мутация в единственном гене, кодирующем регуляторный белок, приводит к формированию лиственных побегов вместо цветков. Мутацияпозволяет клеткам приобрести свойства, которые больше подходят для другой части нормального растения. Мутантное растение изображено слева, дикий тип — справа. (С любезного разрешения EnricoCoen и Rosemary Carpenter.)972Приложение 8.1. Обзор классической генетикиПриложение к главе 8 973974Часть III. Методылюбой человек с серьезным дефектом какого-либо важного процесса, напримеррепликации ДНК, погибнет задолго до рождения.Существует два основных способа изучения человеческих генов.
Во-первых,поскольку гены и их функции сохранялись в течение эволюции, изучение менеесложных модельных организмов дает критическую информацию о сходных генахи процессах в человеке. Соответствующие человеческие гены можно затем изучатьв культивированных человеческих клетках. Во-вторых, многие не летальные мутации, например тканеспецифические дефекты лизосом или рецепторов на поверхности клетки, возникли в человеческой популяции спонтанно.
Анализ фенотиповлюдей с такого рода нарушениями, наравне с изучением их клеток в культуре, далнемало информации о важных функциях человеческих клеток. Несмотря на то чтотакие мутации встречаются редко, их легко найти, благодаря уникальному свойствулюдей: мутантные индивиды привлекают к себе внимание, требуя специальнуюмедицинскую помощь.8.5.2. Генетический скрининг позволяет идентифицировать мутанты со специфическими отклонениямиКак только создана коллекция мутантов модельного организма, напримердрожжей или мушек, для обнаружения интересующего измененного фенотипаобычно необходимо изучить тысячи особей. Такой поиск называется генетическимскринингом, и чем больше геном, тем меньше вероятность того, что какой-либоопределенный ген будет нести мутацию.
Таким образом, чем больше геном организма, тем труднее становится скрининг. Фенотип, поиск которого осуществляетсяпри помощи скрининга, может быть простым или сложным. Простые фенотипылегко обнаружить: например, можно быстро проверить большое число организмовна мутации, делающие невозможным выживание организма в отсутствие определенной аминокислоты или питательного вещества.Более сложные фенотипы, например нарушения поведения или способностик обучению, могут потребовать более трудоемкого скрининга (рис.
8.54). Но методыРис. 8.54. Обнаружение поведенческого фенотипа при генетическом скрининге. (а) C. elegans дикоготипа питаются группами. Черви мигрируют, пока не встречают своих соседей, вместе с которыми они приступают к поеданию бактерий. (б) Мутантные животные питаются сами по себе. (Фотографии полученыCornelia Bargmann, Cell 94: обложка, 1998. С любезного разрешения издательства Elsevier.)Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 975генетического скрининга, применяемые даже для анализа сложных физиологическихсистем, должны быть как можно более простыми и, если возможно, позволять одновременное изучение большого количества мутантов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
