Часть 3 (1129751), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Размеры вступивших в реакцию гибридизации молекул РНК можноопределить путем сравнения со стандартами известного размера при совместномэлектрофорезе в экспериментальной пробе. Так можно обнаружить, что клеткипечени мутантных мышей синтезируют нормального размера мРНК альбуминав нормальном количестве; или что они синтезируют молекулы мРНК нормальногоразмера, но в сильно меньшем количестве.
Возможно также, что мутантные мРНКальбумина патологически короткие. В этом случае фильтр для блоттинга можнозаново проанализировать с более короткими ДНК-зондами, каждый из которыхнесет последовательность только части гена, и посмотреть, какая часть нормальноймРНК отсутствует.Первый метод гель-электрофореза с переносом на мембранный фильтр длягибридизации — Саузерн-блоттинг — направлен на анализ ДНК, а не РНК. (Метод назван по фамилии изобретателя — Саузерна (Southern), а нозерн- и вестернблоттинг получили свои названия по аналогии: southern по-английски означаетюжный, northern (нозерн) — северный, а western (вестерн) — западный. ПосколькуСаузерн-блоттинг назван в честь ученого, термин пишется с большой буквы, тогда как остальные виды блоттинга — с маленькой.) В методе Саузерн-блоттингаизолированные молекулы ДНК сначала расщепляют эндонуклеазами рестрикциина легко разделяемые фрагменты. Двухцепочечные фрагменты затем фракционируютгель-электрофорезом и проводят блоттинг и гибридизацию с ДНК-зондами (см.
рис.8.38). Чтобы охарактеризовать структуру гена альбумина мутантной мыши, нужноиспользовать специфичный к альбумину ДНК-зонд и составить подробную картурестрикции генома в области гена альбумина (она состоит из последовательностейфрагментов ДНК, получающихся при обработке различными рестриктазами). Карта позволяет определить, произошли ли изменения в гене альбумина в мутантныхживотных, например, могла произойти делеция или вставка короткой последовательности ДНК. Однако большинство однонуклеотидных изменений этим методомобнаружить невозможно.В методе Саузерн-блоттинга цепи двухцепочечных молекул ДНК на фильтредолжны быть разделены до начала процесса гибридизации; для этого ДНК после электрофореза подвергают воздействию щелочи, что ведет к ее денатурации(не показано).8.4.6. Гены можно клонировать при помощи библиотек ДНКЛюбой фрагмент ДНК можно клонировать.
В молекулярной биологии термин«клонирование ДНК» используют в двух смыслах. Во-первых, в прямом, то естьв отношении процесса создания множества идентичных копий молекулы ДНК —амплификации определенной последовательности ДНК. Во-вторых, термин такжеописывает выделение конкретного участка ДНК (обычно гена) из всего объемаклеточной ДНК, потому что данный процесс значительно ускоряется путем созданиямножества одинаковых копий интересующей ДНК. Как показано ранее в данной950Часть III. МетодыРис.
8.38. Обнаружение специфическихмолекул РНК или ДНК методом гельпереноса и гибридизации. В данномпримере ДНК-зонд регистрируют по егорадиоактивности. Также широко используют ДНК-зонды, обнаруживаемыехимическими или флуоресцентными методами (см. рис. 8.34). (а) При помощиэлектрофореза разделяют по размерулибо одноцепочечные молекулы РНК(нозерн-блоттинг), либо двухцепочечные фрагменты ДНК, получившиесяв результате обработки рестриктазами(Саузерн-блоттинг). (б) На гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр илиполиамидную бумагу, и разделенные РНКили ДНК переносятся на фильтр путемблоттинга. (в) Нитроцеллюлозный фильтраккуратно снимают с геля. (г) Содержащийсвязанные нуклеиновые кислоты фильтрпомещают в запечатанный полиэтиленовый пакет, наполненный соляным буферным раствором и радиоактивно мечеными ДНК-зондами. Он продолжительноевремя взаимодействует с ДНК-зондамив условиях, способствующих гибридизации.
(д) Фильтр извлекают из пакетаи промывают так, чтобы на бумаге остались только те молекулы зондов, которыегибридизировались с иммобилизованными РНК или ДНК. После радиоавтографиистанут видны полосы ДНК, гибридизовавшейся с мечеными зондами.Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 951главе, термин «клонирование», особенно в контексте биологии развития, также можетотноситься к выращиванию из одной клетки большого числа генетически идентичныхклеток или даже созданию генетически идентичных организмов. В любом случае,клонирование — это процесс создания множества генетически одинаковых копий;в данном разделе мы будем использовать термин «клонирование» (или «клонирование ДНК», или «клонирование гена») по отношению к методам, направленнымна синтез большого числа идентичных копий участка нуклеиновой кислоты.Клонирование ДНК в самом общем смысле может быть произведено несколькими способами.
Наиболее простой — введение определенного фрагмента ДНКв очищенный геном самореплицирующегося генетического элемента — обычновируса или плазмиды. Например, фрагмент ДНК, содержащий человеческий ген,может в пробирке быть сшит с хромосомой вируса бактерий.
Новую рекомбинантную молекулу ДНК затем можно ввести в бактериальную клетку, где вставленныйфрагмент ДНК будет реплицироваться наравне с ДНК вируса. Всего одна такаярекомбинантная молекула ДНК, инфицировавшая единственную клетку, способна,благодаря репликационным механизмам вирусов, дать 1012 идентичных молекулвирусной ДНК меньше чем за день. Таким образом, точно во столько же раз увеличится содержание введенного фрагмента человеческой ДНК. Вирусы или плазмиды,применяемые в этом методе, называют векторами клонирования, и говорят, чторазмноженная путем вставки ДНК клонирована.Для изоляции конкретного гена часто начинают с создания библиотекиДНК — исчерпывающего набора клонированных фрагментов ДНК клетки, тканиили организма.
Эта библиотека включает в себя (мы надеемся) по крайней мереодин участок интересующего гена. Библиотеки можно создать при помощи вирусногоили плазмидного векторов, и обычно их поддерживают в популяции бактериальныхклеток. Принципы, лежащие в основе методов клонирования генов, одинаковыдля обоих типов векторов клонирования, хотя детали могут изменяться. В настоящее время для клонирования чаще используют плазмидные векторы.Наиболее широко используемые для клонирования генов плазмидные векторы — маленькие кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК, выделенные из более крупных плазмид, встречающихся в бактериальных клетках в природе.
Ониобычно содержат лишь малую долю всей ДНК бактериальной клетки-хозяина,но их легко отделить от хромосомной ДНК благодаря небольшому размеру, таккак крупные молекулы при центрифугировании осаждаются в виде гранул. Передиспользованием в качестве векторов клонирования очищенные кольцевые плазмиды расщепляют рестриктазой для получения линейных молекул ДНК. ГеномнуюДНК, необходимую для создания библиотеки, расщепляют той же рестриктазой,и полученные фрагменты рестрикции (включая содержащие ген, который нужноклонировать) добавляют к расщепленным плазмидам. Благодаря наличию липкихконцов в результате отжига образуются рекомбинантные кольцевые молекулыДНК, содержащие чужеродную по отношению к исходной плазмиде ДНК.
Лигазаковалентно сшивает участки ДНК (рис. 8.39).Следующий шаг создания библиотеки — введение рекомбинантных кольцевыхДНК в бактериальные клетки, которые делают временно проницаемыми для ДНК.Это процесс называется трансфекцией. По мере того как клетки растут и делятся,увеличивая свою численность вдвое каждые 30 минут, рекомбинантные плазмидытакже реплицируются.
В результате получают огромное число копий кольцевыхДНК, содержащих чужеродные гены (рис. 8.40). Многие бактериальные плазмиды952Часть III. МетодыРис. 8.39. Вставка фрагмента ДНК в бактериальную плазмиду при помощи фермента ДНК-лигазы.Плазмиду расщепляют эндонуклеазой рестрикции (в данном случае с образованием липких концов)и смешивают с фрагментом ДНК, который нужно клонировать (и приготовленным при помощи той жерестриктазы). Добавляют ДНК-лигазу и ATP. Нуклеотиды на липких концах образуют комплементарныепары, и ДНК-лигаза сшивает одноцепочечные разрывы в ДНК.
В результате получается рекомбинантнаямолекула ДНК. (Микрофотографии получены Huntington Potter и David Dressler.)несут гены устойчивости к антибиотикам (см. главу 24). Это свойство можно использовать для нахождения клеток, трансфекция которых прошла успешно; еслибактерии выращивать в присутствии антибиотика, выживут только те клетки,которые содержат плазмиды. Каждая исходная бактериальная клетка, в которуюввели плазмиду, содержит, в общем случае, различный фрагмент чужеродной ДНК.Этот фрагмент наследуется всеми потомками этой бактерии, которые в чашке Петриформируют маленькие колонии.Много лет плазмиды использовали для клонирования участков ДНК длиной от 1 000 до 30 000 п. н. С более крупными фрагментами ДНК было сложнееработать, и их клонировали с трудом.
Затем ученые начали использовать искус-Рис. 8.40. Амплификация фрагментов ДНК, вставленных в плазмиду. Для получения большого количества интересующей ДНК рекомбинантную плазмидную ДНК (см. рис. 8.39) посредством трансфекциивводят в бактерию, где она будет по мере размножения бактерий реплицироваться миллионы раз.Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 953ственные хромосомы дрожжей (Yeast Artificial Chromosome, YAC), которые способны включать в себя очень крупные куски ДНК (рис. 8.41). В настоящее времядля клонирования фрагментов ДНК длиной от 300 тыс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
