Часть 3 (1129751), страница 19
Текст из файла (страница 19)
В этом методе длинные последовательности ДНК расщепляют случайным образом на более короткие фрагменты.Каждый фрагмент секвенируют, и затем при помощи компьютера, использующегов качестве указателей направления сборки перекрывание последовательностей, этикусочки собирают в целую хромосому или геном. Метод «дробовика» преимущественно применяют для секвенирования маленьких геномов. Несмотря на то чтобольшие, обладающие множеством повторов геномные последовательности сложнеесобирать, метод «дробовика» в сочетании с анализом крупных фрагментов ДНК,клонированных в BAC, сыграл ключевую роль и в их секвенировании.Сейчас, когда все чаще в научной литературе публикуют новые последовательности, сравнение полных геномов различных организмов позволяет нам проследить эволюционные отношения между генами и организмами, а также открыватьновые гены и предсказывать их функции (см.
главы 3 и 4). Приписывание генамфункций часто включает в себя сравнение их последовательностей с родственнымипоследовательностями модельных организмов, которые подробно охарактеризованыв лабораториях, например: бактерии E. coli, дрожжей S. cerevisiae и S. pombe,круглого червя C. elegans и фруктовой мушки Drosophila (см. главу 1).Несмотря на то что организмы, геномы которых расшифрованы, обладаютмногими одинаковыми биохимическими путями и содержат белки, гомологичныепо аминокислотным последовательностям или структуре, функции очень многихнедавно идентифицированных белков остаются неизвестными. В зависимости от ор-966Часть III. МетодыГлава 8.
Манипуляция белками, ДНК и РНК 967Рис. 8.50. Метод ферментативного или дидезокси-секвенирования ДНК. (а) Данный метод основанна использовании дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов — производных нормальных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, у которых отсутствует 3´-гидроксильная группа. (б) Очищенную ДНК синтезируютin vitro в смеси, содержащей секвенируемые одноцепочечные молекулы ДНК (серые), фермент ДНКполимеразу, короткий праймер ДНК (оранжевый), необходимый, чтобы ДНК-полимераза начала синтез,и четыре дезоксирибонуклеотидтрифосфата dATP, dCTP, dGTP, dTTP: синие А, C, G и Т).
Если в смеси такжеприсутствует дидезоксирибонуклеотидный аналог (красный) одного из этих нуклеотидов, он можетбыть вставлен в растущую цепь ДНК. Поскольку в этой цепи не будет 3´-OH-группы, присоединение следующего нуклеотида заблокировано и цепь ДНК в этой точке терминируется. В приведенном примерев нуклеотидную смесь было добавлено небольшое количество дидезоксиATP (ddATP, обозначенныйкрасной буквой А). ddATP конкурирует с избытком нормального дезоксиATP (dATP, голубые А), поэтомуddATP иногда случайным образом включается в растущую цепь ДНК.
Такая реакционная смесь, в концеконцов, даст набор ДНК различной длины, комплементарных исходной секвенируемой ДНК и обрывающихся на разных А. Точные длины продуктов синтеза ДНК можно затем использовать для определенияположения каждого А в растущей цепи. (в) Для определения полной последовательности фрагментаДНК, двухцепочечную ДНК сначала разделяют на отдельные цепи, и одну из цепей используют в качествешаблона для секвенирования. Четыре различных терминирующих цепь дидезоксирибонуклеозидтрифосфата (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP, вновь показаны красным) используют в четырех отдельных реакцияхсинтеза ДНК на копиях одной и той же одноцепочечной ДНК (серая).
Каждая реакция дает набор копийДНК, обрывающихся в различных точках последовательности. Продукты этих четырех реакций разделяют электрофорезом на четырех параллельных дорожках полиакриламидного геля (отмечены здесьбуквами А, C, G и Т). Синтезированные фрагменты обнаруживают по меткам (радиоактивным или флуоресцентным), вставленным в праймер или в один из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, используемыхдля удлинения цепи.
На каждой дорожке полосы представляют собой фрагменты, терминированныена данном нуклеотиде (например, А в самой левой дорожке), но в разных положениях цепи ДНК. Путемсчитывания дорожек по порядку, начиная с нижнего края геля и двигаясь поперек всех дорожек, можноопределить последовательность синтезированной ДНК. Последовательность изображена как зеленаястрелка справа от геля. Эта последовательность комплементарна шаблонной цепи (серая) из исходнойдвухцепочечной молекулы ДНК и идентична части зеленой 5´–3´-цепи.Рис. 8.51. Автоматизированное секвенирование ДНК.
Внизу показана небольшая часть полученныхпри автоматизированном секвенировании ДНК сырых данных, как она выглядят на экране компьютера.Каждый выступающий окрашенный пик представляет собой нуклеотид в последовательности ДНК —здесь можно прочитать нуклеотидную последовательность между положениями 173 и194, считая от начала последовательности. Маленькие пики вблизи нулевой линии представляют собой фоновый «шум»,и до тех пор пока они значительно меньше, чем пики-«сигналы», их игнорируют. Данный пример былвзят из международного проекта по определению полной нуклеотидной последовательности геномарастения Arabidopsis.
(С любезного разрешения George Murphy.)968Часть III. МетодыРис. 8.52. Нахождение участков ДНК, кодирующих белок. (а) Любой участок последовательности ДНК,в принципе, может кодировать шесть различных аминокислотных последовательностей, потому что любая из трех различных рамок считывания на каждой цепи может быть использована для интерпретациинуклеотидной последовательности. Отметим, что нуклеотидная последовательность всегда считываетсяв направлении 5´-3´ и кодирует белок от N-конца к C-концу.
В случае случайной последовательностинуклеотидов, считываемой в определенной рамке, стоп-сигнал синтеза белка встречается в среднемкаждые 20 аминокислот. В данной последовательности из 48 п. н. каждый такой сигнал (стоп-кодон)показан голубым, и только рамка считывания 2 не имеет сигналов остановки. (б) Поиск в последовательности ДНК, состоящей из 1 700 п. н., возможных кодирующих белок последовательностей.
Информацияпредставлена так же, как на (а): каждый стоп-кодон синтеза белка обозначен голубой линией. Также всеучастки между возможными сигналами начала и остановки синтеза белка (смотри стр. 381) показаныкрасным. Только рамка считывания 1 кодирует белок, состоящий из 475 аминокислотганизма, около 15–40 % белков, кодируемых расшифрованным геномом, не похожини на один биохимически исследованный белок. Это наблюдение подчеркиваетограничения расширяющейся области геномики: несмотря на то что сравнительныйанализ геномов дает огромное количество информации о взаимоотношениях междугенами и организмами, он зачастую не дает никакой информации о том, как этигены функционируют, или о том, какую роль они играют в физиологии организма.Например, сравнение полных наборов генов нескольких термофильных бактерийне открыло, почему эти организмы благоденствуют при температурах, превышающих70° C.
А исследование генома невероятно радиоустойчивой бактерии Deinococcusradiodurans не объясняет, как она способна пережить радиационный взрыв, разбивающий стекло. Чтобы понять, как гены и производимые ими белки функционируют в контексте живых организмов, необходимы дальнейшие биохимическиеи генетические исследования, описанные в других разделах этой главы.Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 969ЗаключениеКлонирование ДНК позволяет копировать любую специфическую последовательность ДНК или РНК, выбранную из миллионов других последовательностей в клетке, и синтезировать ее в неограниченных количествах в чистомвиде. Последовательности ДНК могут быть амплифицированы после расщепления хромосомной ДНК эндонуклеазами рестрикции и включения полученныхфрагментов ДНК в хромосомы самореплицирующегося генетического элемента,например вируса или плазмиды. Обычно используют плазмидные векторы,и получаемая в результате «библиотека геномной ДНК» поддерживаетсяв миллионах бактериальных клеток, каждая из которых содержит различныефрагменты ДНК.
Отдельные пролиферирующие клетки из этой библиотекипроизводят большие количества единственного клонированного фрагмента ДНК.Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет напрямую клонировать ДНКтермоустойчивой ДНК-полимеразой при условии того, что последовательностьинтересующей ДНК известна заранее.Родственные подходы используют для получения клонов ДНК, последовательность которых соответствует молекулам мРНК, за исключением того,что сначала получают ДНК-копию последовательности мРНК, называемуюкДНК. В отличие от клонов геномной ДНК, в клонах кДНК отсутствуютпоследовательности интронов, что делает их предпочтительными клонамидля анализа белковых продуктов генов.Реакции гибридизации нуклеиновых кислот являются чувствительнымметодом обнаружения генов или любых других интересующих нуклеотидныхпоследовательностей. В жестких условиях гибридизации (при такой комбинации растворителя и температуры, что даже идеальная двойная спираль ДНКстановится малоустойчивой), две цепи могут спариваться с образованием«гибридной» спирали только в том случае, если их последовательности почтиточно комплементарны.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
