Часть 3 (1129751), страница 14
Текст из файла (страница 14)
С любезного разрешения OxfordUniversity Press (в).)реакции гибридизации могут протекать между любыми двумя одноцепочечныминуклеиновыми кислотами (ДНК/ДНК, РНК/РНК или РНК/ДНК) при условии,что они обладают комплементарными последовательностями нуклеотидов. Такиеспецифичные реакции гибридизации широко применяются для обнаружения и характеристики определенных нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК.Одноцепочечные молекулы ДНК, используемые для обнаружения комплементарных последовательностей, называются зондами; длина этих молекул, несущихрадиоактивные или химические метки для упрощения их обнаружения, колеблетсяв пределах от пятнадцати до нескольких тысяч нуклеотидов. Реакции гибридизации с использованием ДНК-зондов настолько чувствительны и селективны, чтоони позволяют обнаружить комплементарные последовательности, концентрациякоторых не превышает одной молекулы на клетку.
Таким образом, можно определить, сколько копий любой последовательности ДНК содержится в данном образцеДНК. Подобный метод можно использовать для поиска родственных, но не идентичных генов. Например, чтобы найти интересующий ген в организме, чей геномГлава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 945Рис. 8.34. Методы мечения молекул ДНК in vitro. (а) Очищенный фермент ДНК-полимераза метит всенуклеотиды в молекуле ДНК, таким образом синтезируя высокорадиоактивные ДНК-зонды. (б) Полинуклеотидкиназа метит только 5´-концы цепей ДНК; поэтому, когда за мечением следует расщепление эндонуклеазами рестрикции, можно быстро выделить единственную меченую по 5´-концу цепь.(в) Метод на (а) также используют для синтеза нерадиоактивных молекул ДНК, несущих специфическийхимический маркер, который можно обнаружить при помощи соответствующего антитела. Показанныйна рисунке модифицированный нуклеотид в ДНК может быть введен ДНК-полимеразой, что позволяетмолекуле ДНК служить легко обнаруживаемым зондом.
Показанное на рисунке основание на нуклеозидтрифосфате является аналогом тимина, в котором метильная группа на Т заменена спейсернойгруппой, связанной с растительным стероидным гормоном дигоксигенином. Чтобы визуализироватьзонд используют антитело к дигоксигенину, связанное с видимым маркером, например флуоресцентнымкрасителем. К нуклеотидам с тем же результатом можно присоединить и другие химические метки,например, биотин.не был еще секвенирован, в качестве зонда можно использовать часть известногогена (рис. 8.36).946Часть III. МетодыРис.
8.35. Гибридизация in situ для определения местоположения определенных геновв хромосомах. Здесь для маркирования местрасположения соответствующих нуклеотидныхпоследовательностей на хромосоме 5 человека в метафазе использовали шесть различныхДНК-зондов. Зонды метили химическим путеми обнаруживали при помощи флуоресцирующих антител. Показаны обе копии хромосомы 5,расположенные рядом. Каждый зонд дает дветочки на каждой хромосоме, так как метафазнаяхромосома реплицировала свою ДНК и содержит две идентичные спирали ДНК.
(С любезногоразрешения David C. Ward.)С другой стороны, ДНК-зондыможно использовать в реакциях гибридизации с РНК, а не ДНК. Этопозволяет определить, экспрессируетли клетка конкретный ген. В этомслучае зонд, содержащий участок последовательности гена, гибридизуютс РНК, выделенной из интересующей клетки, и смотрят, содержатся ли в РНКнуклеотидные последовательности, совпадающие с ДНК-зондом, и если да, тов каких количествах.
В более трудоемких методах после окончания гибридизацииДНК-зонд подвергают действию специфических нуклеаз для точного нахожденияучастков зонда, связавшихся с молекулами РНК. Таким образом, можно определитьсайты начала и окончания транскрипции РНК, а также точные границы интронныхи экзонных последовательностей в гене (рис. 8.37).Сегодня расположение границ интронов/экзонов обычно определяют при помощисеквенирования комплементарных последовательностей ДНК (кДНК), которыеотражают состав экспрессируемых в клетке мРНК, и сравнения их с нуклеотиднойпоследовательностью генома. Мы ниже опишем, как из мРНК получают кДНК.Гибридизация ДНК-зондов с РНК позволяет определить транскрибируется лиопределенный ген.
Более того, когда экспрессия гена изменяется, можно определить,вызвано ли изменение транскрипционной или посттранскрипционной регуляцией(см. рис. 7.92). Анализ экспрессии генов сначала проводили с одним ДНК-зондом.ДНК-чипы в настоящее время позволяют одновременно следить за сотнями и тысячами генов (рассмотрим этот метод позже). Сегодня методы гибридизации настолько широко применяют в клеточной биологии, что уже трудно представить,как мы могли бы исследовать структуру и экспрессию генов без них.8.4.5. Нозерн-блоттинг и Саузерн-блоттинг ускоряют гибридизациюс разделенными электрофорезом молекулами нуклеиновых кислотВ сложной смеси нуклеиновых кислот ДНК-зонды часто используют для обнаружения только тех молекул, чьи последовательности частично или полностьюкомплементарны зонду.
Перед началом реакции гибридизации при помощи гельэлектрофореза можно разделить по размеру все различные молекулы РНК илиГлава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 947ДНК в необработанной смеси. Если зонд связывается с молекулами только одногоили нескольких размеров, можно быть уверенным, что гибридизация специфична.Более того, информация о размерах молекул сама по себе может оказаться неоценимой. Приведенный ниже пример иллюстрирует это утверждение.Предположим, что необходимо определить природу дефекта в мутантноймыши, который приводит к патологически низкому уровню белка альбумина,который обычно в больших количествах секретируется в кровь клетками печени.Сначала необходимо получить идентичные препараты ткани печени мутантныхи нормальных мышей (последние служат в качестве контроля) и разрушить клеткисильным детергентом для инактивации нуклеаз, которые в противном случае могутрасщепить нуклеиновые кислоты.
Затем нужно отделить РНК и ДНК от другихкомпонентов клеточного гомогената: все белки полностью денатурируют и удаляютмногократным осаждением с фенолом — сильным органическим растворителем,частично смешивающимся с водой; оставшиеся в водной фазе нуклеиновые кислотыРис. 8.36. Жесткие и мягкие условия гибридизации. Для нахождения с помощью ДНК-зонда точногосовпадения используют жесткие условия гибридизации. Температуру поддерживают таким образом,чтобы она была на несколько градусов меньше, чем температура, при которой идеальная спиральДНК денатурирует в данном растворителе (температура плавления). В результате все образующиесянеидеальные двойные спирали нестабильны.
Менее жесткие условия используют, когда ДНК-зондыприменяют для обнаружения как близких, так и идентичных последовательностей. Гибридизацию проводят при более низкой температуре, что позволяет образовываться и неидеальным двойным спиралям.Только в условиях пониженной температуры гибридизацию можно применять для поиска неидентичных,но сходных с геном А генов (C и E в данном примере).948Часть III. МетодыРис. 8.37.
Применение гибридизации нуклеиновых кислот для определения участка фрагмента клонированной ДНК, содержащегося в молекуле мРНК. Метод требует использования нуклеазы, котораяразрезает цепочку ДНК только там, где она не спарена с комплементарной цепью РНК. С его помощьюопределяют расположение интронов в эукариотических клетках. При таком анализе ДНК подвергаютэлектрофорезу через денатурирующий агарозный гель, который заставляет ДНК двигаться в формеодноцепочечных молекул. Расположение каждого конца молекулы РНК можно определить родственными методами.осаждают спиртом, чтобы отделить их от различных малых молекул клетки.
Затем ДНК отделяют от РНК за счет их различной растворимости в спиртах, а всенежелательные загрязняющие нуклеиновые кислоты разрушают путем обработкивысокоспецифичными ферментами — РНКазами (рибонуклеазами) или ДНКазами(дезоксирибонуклеазами). мРНК обычно отделяют от РНК других типов молекулРНК на хроматографической колонке, специфически связывающей поли(А) «хвосты» мРНК.Для анализа кодирующих альбумин мРНК используют метод, носящий название нозерн-блоттинга (Northern Blotting).
Сначала интактные молекулы мРНК,выделенные из мутантных и контрольных клеток печени, фракционируют на отдельные полосы гель-электрофорезом в соответствии с их размером. Затем, чтобымолекулы РНК стали доступными для ДНК-зондов, создают реплику профиля полосГлава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 949РНК на геле путем переноса («блоттинга») разделенных молекул РНК на нитроцеллюлозный фильтр или полиамидную бумагу. Фильтр затем инкубируют в растворе, содержащем меченые ДНК-зонды, последовательности которых частичносоответствуют цепи, кодирующей мРНК альбумина. Молекулы мРНК, которыебудут гибридизироваться с меченым ДНК-зондом на фильтре (так как они комплементарны части нормальной последовательности гена альбумина), затем локализуютпутем обнаружения связанного зонда радиоавтографией или химическими способами(рис. 8.38).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
