Часть 3 (1129751), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Это геном бактерии Haemophilus influenzaeГлава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 94119961996–1997199820012004Goffeau и международный консорциум ученых объявляют о завершении проектапо расшифровке первого эукариотического генома дрожжей Saccharomyces cerevisiaeLockhart и его коллеги Brown и DeRisi создают ДНК-чипы, позволяющие одновременно наблюдать за тысячами геновSulston и Waterston и их коллеги получают первую полную последовательностьгенома многоклеточного организма, круглого червя Caenorhabditis elegansКонсорциум ученых объявляет о получении предварительной последовательностичеловеческого геномаПубликация «конечной» последовательности человеческого геномануклеотидов.
Эти последовательности в местах, где они встречаются в геномесамой бактерии, защищены от рестрикции метилированием нуклеотидов А или C;последовательности в чужеродной ДНК обычно не метилированы и поэтому онирасщепляются рестриктазами. Из различных видов бактерий выделено множествоэндонуклеаз рестрикции; несколько сотен, большинство из которых распознаютразличные нуклеотидные последовательности, есть в продаже.Некоторые эндонуклеазы рестрикции вносят ступенчатые разрывы, в результате чего на концах каждого фрагмента ДНК остаются короткие одноцепочечные«хвостики» (рис. 8.31).
Такие концы называются липкими, поскольку каждый«хвостик» может комплементарно спариться с «хвостиком» на конце любого другогофрагмента, полученного при помощи той же рестриктазы (рис. 8.32). Полученныепри помощи эндонуклеаз рестрикции липкие концы позволяют легко соединять другс другом любые два фрагмента ДНК, если эти фрагменты получены при помощиодной и той же рестриктазы (или другой рестриктазы, дающей такие же липкиеконцы). Молекулы ДНК, полученные путем соединения двух или более фрагментовДНК, носят название рекомбинантных молекул ДНК.8.4.2. Гель-электрофорез позволяет разделить молекулы ДНКразличных размеровМетоды гель-электрофореза, подтвердившие свою полезность для анализабелков, точно так же позволяют определить длину и чистоту молекул ДНК. Процесс даже проще, чем в случае белков: поскольку каждый нуклеотид в молекулахнуклеиновых кислот изначально несет один отрицательный заряд (на фосфатнойгруппе), нет необходимости добавлять отрицательно заряженный детергент ДСН,который нужен для того, чтобы молекулы белков двигались в сторону положительного электрода.
Дляфрагментов ДНК длиной менее 500 нуклеотидов, разработаны специальные полиакриламидные гели, позволяющие разделять молекулы,отличающиеся по длине всего на один нуклеотид (рис. 8.33, а). Однако поры в полиакриламидных гелях слишком малы для того, чтобы пропускать очень большиемолекулы ДНК; для разделения крупных молекул из разбавленных растворовагарозы (полисахарида, выделяемого из морских водорослей) делают более пористые гели (рис. 8.33, б).
Эти методы разделения ДНК широко используют какдля аналитических, так и препаративных целей.Одна из разновидностей электрофореза в агарозном геле — гель-электрофорезв градиенте пульсирующего поля, позволяющий разделять даже очень длинныемолекулы ДНК. Обычный гель-электрофорез не способен идентифицировать такие942Часть III. МетодыРис. 8.31. Нуклеотидные последовательности ДНК, распознаваемыечетырьмя широко применяемыми эндонуклеазами рестрикции.На рисунке видно, что такие последовательности часто содержатшесть пар нуклеотидов и являются палиндромами (то есть нуклеотидная последовательность остается такой же при повороте спиралина 180 градусов вокруг центра распознаваемого ферментом короткогоучастка молекулы). Ферменты расщепляют обе цепочки ДНК вблизираспознаваемой последовательности или в ее центре.
Некоторыеэндонуклеазы рестрикции, например Hpal, оставляют после расщепления тупые концы; другие же, например EcoRI, HindIII и PstI, вносятступенчатые разрывы, приводящие к образованию липких концов.Эндонуклеазы рестрикции получают из различных видов бактерий:Hpal из Haemophilus parainfluenzae, EcoRI из Escherichia coli, HindIIIиз Haemophilus influenzae, а PstI из Providencia stuartii.молекулы, потому что постоянное электрическое полезаставляет их вытягиваться таким образом, что онидвижутся через гель концом вперед в змеевидных конфигурациях со скоростью, не зависящей от их длины.При гель-электрофорезе в градиенте пульсирующегополя направление электрического поля периодическименяется, что заставляет молекулы переориентироваться, прежде чем они продолжат свое змеевидное движение через гель. Такая переориентация длится гораздодольше в случае крупных молекул, поэтому длинныемолекулы движутся медленнее, чем короткие.
В результате даже целые бактериальные или дрожжевыехромосомы в геле с градиентом пульсирующего поляразделяются на отдельные полосы, и становятся возможными их классификацияи идентификация на основе размера (рис. 8.33, в). Несмотря на то что типичнаяхромосома млекопитающих, состоящая из 108 п. н., слишком велика для очисткиэтим методом, большие участки этих хромосом легко разделяют и идентифицируют,если предварительно хромосомную ДНК обработать рестриктазами, расщепляющими ДНК по редко встречающимся сайтам (единожды на каждые 10 тыс. илиболее нуклеотидных пар).Полосы ДНК в агарозном или полиакриламидном геле невидимы, если ДНК небыла окрашена или помечена. Один из наиболее чувствительных методов окрашивания ДНК— обработка ее красителем бромидом этидия, который при связываниис ДНК флуоресцирует в ультрафиолете (см.
рис. 8.33, б, в). В еще более чувствительном методе детекции до электрофореза в молекулу ДНК включают радиоизотоп;часто используют 32P, поскольку его можно включить в фосфатные группы ДНК,и он испускает высокоэнергетическую β-частицу, которую легко зарегистрироватьрадиоавтографией, как на рис. 8.33 (описание радиоизотопов см. на стр. 601).8.4.3. Очищенные молекулы ДНК можно специфически метитьпри помощи радиоизотопов или химических маркеров in vitroДля мечения изолированных молекул ДНК широко используют два метода.В первом ДНК-полимераза копирует ДНК в присутствии радиоактивных (обычноГлава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 943Рис. 8.32.
Применение эндонуклеаз рестрикциидля получения легко соединяемых друг с другом фрагментов ДНК. Фрагменты с одинаковыми липкими концами можно легко соединитьза счет комплементарного спаривания нуклеотидов на их липких концах. В данном примередва сшивающихся друг с другом фрагмента ДНКполучены при помощи рестриктазы EcoRI, тогдакак три других фрагмента — при помощи другихрестриктаз, дающих другие липкие концы (см.рис. 8.32).
Фрагменты с тупыми концами, получающиеся, например, при использовании Hpal(см. рис. 8.31), сшить друг с другом сложнее.меченных фосфором 32P) или химически маркированных нуклеотидов(рис. 8.34, а). Это позволяет получатьдля реакций гибридизации нуклеиновых кислот (описанных ниже) «зондыДНК», содержащие множество меченых нуклеотидов. Во втором ферментбактериофагов полинуклеотидкиназапереносит единственный меченный 32P фосфат с ATP на 5´-конец каждой цепочкиДНК (рис. 8.34, б). Поскольку киназа вставляет в каждую цепь ДНК только одинатом 32P, меченные таким образом молекулы ДНК часто недостаточно радиоактивны, чтобы их можно было использовать в качестве зондов.
Однако, поскольку онимечены только с одного конца, их можно использовать в других методах, включаяфутпринтинг ДНК, описанный в главе 7.Методы радиоактивного мечения постепенно замещают мечением молекулами,которые можно обнаружить химически или c помощью флуоресценции. Для получения таких нерадиоактивных молекул ДНК, используют специально модифицированные предшественники нуклеотидов (рис. 8.34, в).
Синтезированная такимобразом молекула ДНК может связываться с комплементарной последовательностьюДНК путем гибридизации, как описано в следующем разделе. Затем ее детектируют при помощи антитела (или другого лиганда), специфически распознающего еемодифицированную боковую цепь (рис. 8.35).8.4.4. Реакции гибридизации нуклеиновых кислот — чувствительный способ обнаружения специфических последовательностейнуклеотидовКогда водный раствор ДНК нагревают до 100° C или подвергают действиюочень высокого pH (pH ≥ 13), комплементарные п. н., которые в нормальных условиях держат вместе цепи двойной спирали ДНК, разрушаются, и двойная спиральбыстро диссоциирует на две одиночные цепочки. Этот процесс, носящий названиеденатурации ДНК, много лет считали необратимым.
Однако в 1961 г. обнаружили, что комплементарные одиночные цепи ДНК легко восстанавливают двойныеспирали в результате процесса, называющегося гибридизацией (или ренатурациейДНК), если их держать продолжительное время при температуре 65° C. Сходные944Часть III.
МетодыРис. 8.33. Методы гель-электрофореза для разделениямолекул ДНК по размеру. В трех приведенных примерах электрофорез проходит сверху вниз, поэтому самыекрупные молекулы ДНК (и поэтому самые медленные)располагаются вверху геля. (а) Для разделения одноцепочечной ДНК использовали полиакриламидный гель с маленькими порами. Молекулы ДНК, состоящие из 10–500нуклеотидов, можно разделить по размеру с точностьюдо одного нуклеотида. В данном примере четыре полосыпредставляют собой наборы молекул ДНК, синтезированных во время ее секвенирования.
Секвенируемую ДНКискусственно реплицировали с фиксированного сайтадо различных конечных точек, что дало набор частичносовпадающих молекул разной длины. (На рис. 8.50 показан синтез таких частичных реплик.) На дорожках 1–4 —все частичные реплики, оканчивающиеся на G, A, T и Ссоответственно. Поскольку в этих реакциях использовалирадиоактивно меченые молекулы ДНК, их положениеможно определить при помощи радиоавтографии.(б) Для разделения двухцепочечных молекул ДНК использовали агарозный гель с порами среднего размера. Этимолекулы ДНК представляют собой фрагменты, полученные путем расщепления вирусного генома рестриктазами. Полосы зарегистрированы благодаря флуоресценциикрасителя бромида этидия. (в) Для разделения шестнадцати дрожжевых хромосом, длина которых колеблетсяв пределах от 220 тыс. до 2,5 млн.
п. н., использовалиметод гель-электрофореза в градиенте пульсирующегополя. ДНК окрашена, как на (б). Этот метод позволяетразделить молекулы ДНК длиной до 107 п. н. (C любезного разрешения Leander Lauffer и Peter Walter (а); KenKreuzer (б); D. Vollrath and R. W. Davis, Nucleic Acids Res.15: 7865–7876, 1987.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
