Часть 3 (1129751), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Рентгеновские лучи,как и свет, представляют собой вид электромагнитного излучения, но они обладают932Часть III. МетодыРис. 8.27. Малые молекулы-ингибиторы для манипуляции живыми клетками. (а) Химическая структурамонастрола — ингибитора кинезина, обнаруженного путем широкомасштабного скрининга малых молекул, нарушающих митоз. (б) Нормальное митотическое веретено деления, наблюдаемое в интактныхклетках.
Микротрубочки окрашены зеленым, хромосомы — синим. (в) Однополюсное веретено деления,образующееся в клетках, обработанных монастролом. (б и в из T. U. Mayer et al., Science 286: 971–974,1999. С любезного разрешения издательства AAAS.).меньшей длиной волны, обычно около 0,1 нм (диаметр атома водорода). Если узкийпараллельный пучок рентгеновских лучей направить на образец чистого белка,большинство лучей пройдут прямо насквозь.
Однако маленькая их часть будетрассеиваться за счет взаимодействия с атомами в образце. Если проба представляетсобой высокоупорядоченный кристалл, рассеянные лучи в определенных точкахбудут усиливать друг друга, и в специальном детекторе они будут отображатьсякак дифракционные пятна (рис. 8.28). Положение и интенсивность каждого пятна на изображении рентгеновскойдифракции дают информацию о положении атомов, вызвавших рассеяние лучей,в кристалле.
Расшифровка трехмерной структуры большой молекулы — это сложнаязадача. Она не была разрешена вплоть до 1960 г. Но в последние годы рентгеноструктурный анализ стал автоматизированным, и сейчас самым медленным шагомобычно бывает получение подходящих кристаллов белка. Для этого необходимыГлава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 933большие количества очень чистого белка, и часто на нахождение правильных условийкристаллизации уходят годы проб и ошибок. Скорость значительно увеличилась после начала использования метода рекомбинантных ДНК для получения чистого белкаи роботизированных методов анализа большого числа условий кристаллизации.Анализ получившейся дифракционной картины дает сложную трехмернуюкарту электронной плотности.
Интерпретация этой карты — перевод ее контуровв трехмерную структуру — представляет собой сложный процесс, требующийзнания аминокислотной последовательности белка. Обычно методом проб и ошибок последовательность и карта электронной плотности соотносятся друг с другомна компьютере с получением наилучшего совпадения. Надежность получившейсяатомной модели зависит от разрешения исходных кристаллографических данных:разрешение 0,5 нм может дать слабое разрешение полипептидной цепи, тогда какпри 0,15 нм можно надежно предсказать положение всех не водородных атомов.Полная атомная модель часто слишком сложна, для того чтобы рассматриватьее напрямую, поэтому ее обычно представляют в качестве упрощенной версии,демонстрирующей основные структурные свойства белка (см.
приложение 3.2,стр. 132–133). На данный момент методами рентгеновской кристаллографии и ЯМРспектроскопии (см. ниже) расшифрованы трехмерные структуры около 20 тысячразличных белков. Этого оказалось достаточно для обнаружения семейств частовстречаемых структур. Эти структуры или способы сворачивания белков частов течение эволюции остаются неизменными, в отличие от образующих их аминокислотных последовательностей (см.
рис. 3.13).Методы рентгеновской кристаллографии также можно применять для изучениямакромолекулярных комплексов. Последнее великое достижение — это расшифровка структуры рибосомы, большой и сложной машины, состоящей из несколькихмолекул РНК и более 50-ти белков (см. рис.
6.64). Расшифровка потребовалаиспользования синхротрона — источника рентгеновских лучей, интенсивностькоторого достаточно велика для анализа кристаллов такого крупного макромолекулярного комплекса.8.3.13. Использование ЯМР для расшифровки структуры белка враствореЯдерную магнитно-резонансную (ЯМР) спектроскопию много лет широкоиспользуют для анализа структуры малых молекул. Этот метод сейчас все чащеприменяют для изучения небольших белков или белковых доменов. В отличиеот рентгеноструктурного анализа, для ЯМР не нужен кристаллический образец.Все, что необходимо, — это небольшой объем концентрированного раствора белка,помещаемый в сильное магнитное поле. ЯМР является основным методом полученияподробной информации о трехмерной структуре молекул в растворе.Определенные ядра атомов, в особенности водородные ядра, обладают магнитным моментом или спином, то есть они обладают внутренней намагниченностью, как стрежневой магнит. Спин ориентируется вдоль направления сильногомагнитного поля, но его можно перевести в хаотическое возбужденное состояниепод воздействием радиочастотных импульсов электромагнитного излучения.
Когдавозбужденные ядра водорода возвращаются в исходную ориентацию, они испускаютрадиочастотное излучение, которое можно измерить и выразить в виде спектра.Природа испускаемого излучения зависит от окружения каждого атома водорода,934Часть III. Методыи если одно ядро возбуждено, то оно будет влиять на поглощение и испусканиедругих близлежащих ядер. Затем при помощи искусного применения базовогометода ЯМР, известного как двумерный ЯМР, можно различить сигналы водородов различных аминокислотных остатков и измерить малые смещения в этихсигналах, происходящие, если эти ядра водородов лежат достаточно близко длявзаимодействия.
Поскольку величина этих смещений указывает на расстояниемежду взаимодействующими парами водородных ядер, метод ЯМР способен даватьинформацию о расстояниях между частями белковой молекулы. Совмещение этихданных с аминокислотной последовательностью позволяет рассчитать трехмернуюструктуру белка (рис. 8.29).В связи с техническими ограничениями ЯМР- спектроскопия позволяет хорошоопределять только структуру маленьких белков с молекулярной массой до 20 кДа.Разрешение падает с увеличением размера макромолекулы.
Но последние технические разработки увеличили предел до 100 кДа, что сделало ЯМР-спектроскопиюдоступной для структурного анализа большинства белков.Рис. 8.28. Рентгеноструктурный анализ. (а) Узкий пучок параллельных рентгеновских лучей направляют на высокоупорядоченный кристалл. (б) Здесь показан кристалл белка рибулозо1,5-бифосфаткарбоксилазы, фермента, играющего центральнуюроль в фиксации CO2 при фотосинтезе. Атомы кристалла рассеивают некоторые лучи, и рассеянные волны усиливают друг другав определенных точках, регистрируемых в качестве дифракционных пятен (в). Эта дифракционная картина и аминокислотнаяпоследовательность белка могут быть использованы для получения атомной модели (г). Полноатомную модель сложно интерпретировать, но ее упрощенный вид, полученный из данныхрентгеновской дифракции, наглядно демонстрирует структурныесвойства белка (α-спирали показаны зеленым, β-листы — красным). Компоненты на рисунках а–г показаны не в масштабе.(с любезного разрешения C. Branden (б); J. Hajdu и I. Andersson (в);адаптировано из оригинала, предоставленного B.
Furugren (г).)Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 935Поскольку ЯМР требует использования растворов веществ, данный методтакже подходит, например, для наблюдения за изменением структуры белков прифолдинге или связывании белком другой молекулы. ЯМР также широко применяют для исследования отличных от белков молекул, он очень полезен, например,в качестве метода определения трехмерной структуры молекул РНК и сложныхуглеводных боковых цепей гликопротеинов.Некоторые основные этапы развития рентгеноструктурного анализа и ЯМРспектроскопии перечислены в таблице 8.2.8.3.14. Последовательность и структура белка могут указать на егофункциюОбсудив методы очистки и анализа белков, обратимся к обычной ситуациив клеточной и молекулярной биологии — исследователь идентифицировал важныйдля биологического процесса ген, но не знает биохимических свойств его белковогопродукта.Благодаря стремительному увеличению количества последовательностей белкови нуклеиновых кислот в геномных базах данных, функция гена — и кодируемогоим белка – часто может быть предсказана путем простого сравнения его последовательности с уже охарактеризованными (см.
рис. 3.14). Поскольку аминокислотнаяпоследовательность определяет структуру белка, а структура определяет биохимическую функцию, белки со сходными аминокислотными последовательностями частообладают сходной структурой и, следовательно, выполняют одинаковые биохимические функции. Это справедливо даже для белков из неродственных организмов.В современной клеточной биологии изучение недавно открытого белка обычноначинается с поиска ранее охарактеризованных белков, обладающих сходнымиаминокислотными последовательностями.Поиск гомологичных генов или белков среди известных последовательностейобычно производится во всемирной паутине. Необходимо просто выбрать базуданных и ввести нужную последовательность.
Программа совмещения последовательностей — наиболее популярны BLAST и FASTA — ищет в базе данныхсходную последовательность путем перемещения предложенной пользователемпоследовательности вдоль содержащихся в базе до тех пор, пока не найдет полноеили частичное совпадение кластера аминокислотных остатков (рис. 8.30). Результат даже сложного поиска, который может производиться с последовательностьюнуклеотидов или аминокислот, возникнет на экране через несколько минут. Такоесравнение может помочь предсказать функцию отдельных белков, белковых семействили даже большей части белков только что секвенированного организма.В главе 3 показано, что многие белки, имеющие одинаковую конформациюи выполняющие сходные функции, обладают слишком далеким родством, и ихнельзя идентифицировать как гомологичные, только сравнивая их аминокислотнуюпоследовательность (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
