Часть 3 (1129751), страница 12
Текст из файла (страница 12)
рис. 3.13). Таким образом, возможность надежно предсказывать трехмерную структуру белка на основе его аминокислотной последовательности улучшила бы нашу способность выводить функцию белка из информациио последовательностях в геномных базах данных. В последние годы наблюдаетсязначительный прогресс в предсказании точной структуры белка.
Эти предсказания,с одной стороны, основываются на информации о десятках тысяч структур белков,расшифрованных при помощи рентгеноструктурного анализа и ЯМР-спектроскопии,936Часть III. Методыа с другой — на вычислениях, берущих начало в наших знаниях о действующих наатомы физических силах. Однако предсказание структуры больших или мультидоменных белков или структур с высоким разрешением для компьютерного дизайналекарств до сих пор остается сложной и важной задачей.Нахождение для нового белка гомологичных последовательностей и структурможет помочь раскрыть его функцию, но обычно эти предсказания необходимопроверить прямым экспериментом. Полученная совмещением последовательностейинформация, однако, часто может указать направление экспериментов, что делаетэтот метод одним из наиболее важных в современной клеточной биологии.ЗаключениеБольшинство белков функционирует совместно с другими белками.
Существует множество методов идентификации и изучения белок-белковых взаимодействий. Малые молекулы-ингибиторы позволяют исследовать функциибелков, на которые они действуют, в живой клетке. Поскольку белки со сходнойструктурой часто выполняют сходные функции, биохимическую активностьбелка можно предсказать путем поиска в базах данных ранее охарактеризованных белков со сходной аминокислотной последовательностью.Рис.
8.29. ЯМР-спектроскопия. (а) Пример данных, полученных при помощи установки ЯМР. Данныйдвумерный спектр ЯМР получен для C-концевого домена фермента целлюлозы. Пятна показываютвзаимодействие между ядрами водорода, лежащими в белке вблизи других водородных атомов, и,значит, можно определить расстояния, разделяющие ядра. Сложные вычислительные методы в сочетании с известной аминокислотной последовательностью позволяют получить согласующиеся структуры.(б) Показана суперпозиция десяти структур фермента, равно удовлетворяющих ограничениям на расстояния. Такое представление дает достаточную информацию о возможной трехмерной структуре.(С любезного разрешения P. Kraulis.)Глава 8.
Манипуляция белками, ДНК и РНК 937Таблица 8.2. Основные этапы развития рентгеноструктурного анализа и ЯМР-спектроскопии и их применения к биологическим молекулам18641895191219261931193419351941194619511953195419601966197119761977–19781985Hoppe-Seyler кристаллизует гемоглобин и дает ему названиеRöntgen наблюдает новый вид проникающего излучения при попадании катодныхлучей (электронов) на металлическую мишень. Он называет это излучение X-лучами(в русской традиции «рентгеновские лучи»)von Laue получает первую дифракционную картину при пропускании рентгеновскихлучей через кристалл сульфата цинкаW. L. Bragg предлагает простое математическое соотношение между дифракционнойкартиной и расположением атомов в кристаллеSumner выделяет фермент уреазу из экстракта канавалии мечевидной и показывает,что белок обладает каталитической активностьюPauling публикует свое первое эссе «Природа химической связи», в котором подробноописывает принципы ковалентного связыванияBernal и Crowfoot представляют первую подробную рентгеновскую дифракционнуюкартину белка, полученного из кристаллов фермента пепсинаPatterson разрабатывает аналитический метод определения межатомных расстоянийиз данных рентгеновской кристаллографииAstbury получает первую рентгенограмму ДНКBlock и Purcell описывают ЯМРPauling и Corey предлагают структуры спиральной конформации цепи L-аминокислот— α-спирали — и β-листа.
Обе структуры впоследствии обнаружены во многихбелкахWatson и Crick на основе рентгенограммы, полученной Franklin и Wilkins, предлагаютмодель двойной спирали ДНКPerutz и его коллеги разрабатывают методы тяжелых атомов для решения проблемыфаз в кристаллографии белковKendrew подробно описывает структуру белка (миоглобина кашалота) с разрешением 0,2 нмPerutz представляет структуру большего белка гемоглобина с меньшим разрешениемPhillips описывает структуру лизоцима.
Это первое подробное описание ферментаJeener предлагает использовать двумерный ЯМР, Wuthrich и его коллеги впервыеиспользуют метод для расшифровки структуры белка в начале 80-хKim и Rich и Klug и коллеги последнего подробно описывают трехмерную структурутРНК, полученную при помощи рентгеноструктурного анализаHolmes и Klug расшифровывают структуру вируса табачной мозаики (ВТМ), а Harrisonи Rossman определяют структуру двух маленьких сферических вирусовMichel, Deisenhofer и их коллеги при помощи рентгеноструктурного анализа впервыерасшифровывают структуру трансмембранного белка (бактериального реакционногоцентра).
Henderson и его коллеги в 1975–1990 гг. получают структуру трансмембранного белка бактериородопсина методами электронной микроскопии высокогоразрешения8.4. Анализ и манипуляция ДНКВплоть до 70-х гг. ДНК оставалась наиболее сложной для биохимическогоанализа молекулой. Очень длинная и химически однородная последовательностьнуклеотидов, формирующая генетический материал организма, могла быть иссле-938Часть III. МетодыРис. 8.30.
Результаты поиска с помощью программы BLAST. В базах данных можно искать сходныеаминокислотные или нуклеотидные последовательности. Здесь поиск белков, похожих на человеческийбелок-регулятор клеточного цикла Cdc2 (Query — Запрос), возвращает Cdc2 из кукурузы (Sbjct — Объект), который по аминокислотной последовательности на 68 % идентичен (Identities — Совпадения)человеческому Cdc2, а на 82 % на него похож (Positives — Сходства).
Совмещение начинается с остатка57 белка Query. Это говорит о том, что у человеческого белка есть N-концевой участок, отсутствующийу белка кукурузы. Зеленые блоки показывают различия в последовательностях, а желтые – их совпадение: когда две аминокислотные последовательности идентичны, показывается остаток; консервативныеаминокислотные замены обозначают плюсом (+). Введен только один пропуск (Gap) , он показан краснойстрелкой в положении 194 в последовательности Query.
Это сделано для максимального совмещения.Итог совмещения (Score), выражаемый в двух разных единицах измерения, учитывает штрафы за замены и пропуски; чем выше итог совмещения, тем лучше совпадение. Достоверность совпадения отражена в величине ожидания (Expect), которая показывает, как часто такое хорошее совмещение можетпроизойти случайно. Чем меньше значение Expect, тем достовернее совпадение; здесь Expect оченьмало (e–111), что говорит о гомологичности белков.
Значения Expect, превышающие 0,1, показывают, чтобелки скорее всего не родственны. Например, Expect = 0,1 означает, что такое совпадение случайно в 1из 10 случаев.дована только косвенно путем секвенирования белков или РНК или с помощьюгенетического анализа. В настоящее время ситуация полностью изменилась.
ДНКперестала быть наиболее сложной для анализа макромолекулой в клетке, наоборот,теперь ее анализировать проще всего. Можно изолировать конкретный участокпрактически любого генома, получить неограниченное количество его копий и расшифровать его нуклеотидную последовательность всего за несколько часов. На пикепроекта «Геном человека» крупные лаборатории круглые сутки со скоростью 1 000нуклеотидов в минуту синтезировали последовательности ДНК на автоматическомоборудовании. Родственные методы позволяют произвольно изменять (конструировать) изолированные гены и переносить их обратно в зародышевые линии животных или растений, где они становятся функционирующей и наследуемой частьюгенома организма.Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 939Эти технические прорывы в генной инженерии — науке, занимающейсявысокоточными методами работы с ДНК в пробирке или организме, — повлиялина все аспекты клеточной биологии, невероятно ускорив изучение клеток и ихмакромолекул.
Методы рекомбинантных ДНК объединяют несколько методик,часть из которых разработана совсем недавно, а часть позаимствована из другихобластей, например, генетики микробов (таблица 8.3). В основе метода лежатследующие ключевые методы:1. Расщепление ДНК в специфических сайтах эндонуклеазами рестрикции,значительно ускоряющее изоляцию отдельных генов и работу с ними.2. Лигирование ДНК, позволяющее проектировать и конструировать молекулыДНК, не встречающиеся в природе.3. Клонирование ДНК с использованием либо клонирующих векторов, либополимеразной цепной реакции, при которой участок ДНК многократно копируетсядля синтеза миллиардов идентичных молекул.4.
Гибридизация, позволяющая с большой точностью и аккуратностью обнаружить конкретную последовательность ДНК или РНК на основании способностинуклеиновых кислот селективно связываться с комплементарными последовательностями.5. Быстрая расшифровка любой последовательности ДНК (даже целых геномов), что позволяет идентифицировать гены и определить аминокислотную последовательность кодируемых ими белков.6. Одновременное наблюдение за уровнем синтезируемой каждым геномв клетке РНК при помощи нуклеотидных микрочипов, в которых одновременнопроисходят десятки тысяч реакций гибридизации.В данном разделе мы опишем каждый из этих базовых методов, радикальноизменивших область исследования клеточной биологии.8.4.1. Рестриктазы разрезают большие молекулы ДНК на фрагментыВ отличие от белков, гены в клетке не существуют как отдельные единицы,они представляют собой маленький участок значительно более длинной молекулыДНК.
Несмотря на то что молекулы ДНК в клетке могут быть случайным образомразрушены механической силой, участок, содержащий единственный ген геномамлекопитающего, будет лишь одним из сотни тысяч (или даже больше) фрагментовДНК, в среднем не различающихся по размеру. Как выделить такой ген? Посколькувсе молекулы ДНК состоят из примерно одинаковой смеси одних и тех же четырехнуклеотидов, их нельзя быстро очистить, как белки, на основании различных зарядов и способности к связыванию.Все эти проблемы нашли свое решение с открытием эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). Эти ферменты, выделяемые из бактерий, расщепляют двойнуюцепочку ДНК в определенных сайтах со специфической нуклеотидной последовательностью.
В результате длинная двухцепочечная молекула ДНК оказываетсяразрезанной на фрагменты определенного размера. Разные рестриктазы специфичнык разным последовательностям нуклеотидов, поэтому найти фермент, способный датьфрагмент ДНК, содержащий нужный ген, относительно просто. Затем на основеразмера полученного фрагмента ДНК проводят частичную очистку гена в смеси.Различные виды бактерий синтезируют различные эндонуклеазы рестрикции,защищающие их от вирусов путем деградации вирусной ДНК. Каждая бактериальная рестриктаза узнает специфическую последовательность из четырех–восьми940Часть III.
МетодыТаблица 8.3. Основные этапы развития метода рекомбинантных ДНК и трансгенных технологий186919441953195519611962196619671972–197319751975-19771981–1982198219851987198919891990199019911995Miescher впервые выделяет ДНК из белых кровяных телец, полученных из пропитанных гноем бинтов из близлежащей больницыAvery доказывает, что ДНК, а не белок, является носителем генетической информацииво время бактериальной трансформацииWatson и Crick на основе рентгеноструктурных данных Franklin и Wilkins предлагаютмодель двойной спирали ДНКKornberg открывает ДНК-полимеразу, фермент, который в настоящее время используют для создания препаратов меченой ДНКMarmur и Doty открывают ренатурацию ДНК и показывают специфичность и реализуемость реакций гибридизации нуклеиновых кислотArber получает первые доказательства существования эндонуклеаз рестрикции ДНК,что приводит к их выделению и использованию для описания последовательностейДНК Nathans и H.
SmithNirenberg, Ochoa и Khorana расшифровывают генетический кодGellert открывает ДНК-лигазу, фермент, используемый для сшивания фрагментовДНК друг с другомСотрудники лабораторий Boyer, Cohen и Berg, а также их коллеги в УниверситетеСтэнфорда и Университете Калифорнии в Сан-Франциско, разрабатывают методыклонирования ДНКSouthern для обнаружения специфических последовательностей ДНК разрабатываетметод гель-электрофореза и переноса разделенной по длине ДНК на мембранныйфильтр для гибридизацииSanger и Barrel и Maxam и Gilbert разрабатывают методы быстрого секвенированияДНКPalmiter и Brinster получают трансгенных мышей; Spradling и Rubin — трансгенныхфруктовых мушекВ Национальной лаборатории в Лос-Аламосе создается GenBank — общедоступнаябаза данных генетических последовательностей, поддерживаемая Национальныминститутом здоровья США (National Institute of Health, NIH)Mullis и его сотрудники разрабатывают метод цепной полимеразной реакции(ПЦР)Capecchi и Smithies представляют метод направленной замены генов в эмбриональных стволовых клетках мышейFields и Song разрабатывают метод дрожжевых двугибридных систем для идентификации и исследования белковых взаимодействийOlson и его коллеги описывают ДНК-маркирующие сайты, уникальные последовательности ДНК, используемые для составления физических карт человеческиххромосомLipman и его коллеги выпускают BLAST — алгоритм поиска гомологии среди последовательностей ДНК и белковSimon и его коллеги изучают, как эффективно использовать бактериальные искусственные хромосомы (Bacterial Artificial Chromosome, BAC) для переноса большихфрагментов клонированной человеческой ДНК при секвенированииHood и Hunkapillar представляют новую автоматизированную технологию секвенирования ДНКVenter и его коллеги впервые секвенируют целый геном.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
