Часть 3 (1129751), страница 16
Текст из файла (страница 16)
до 1 млн п. н. используютновый плазмидный вектор, основанный на встречающейся в E. coli в естественныхусловиях F-плазмиде. В отличие от меньших по размеру бактериальных плазмид,F-плазмида и ее производная — бактериальная искусственная хромосома (Bacterial Artificial Chromosome, BAC) — в клетке E.
coli присутствуют только в однойили двух копиях. Возможно, тот факт, что BAC содержится в бактериальныхклетках в таком малом количестве, является причиной ее способности стабильноРис. 8.41. Создание искусственной хромосомы дрожжей (YAC). Вектор YAC позволяет клонировать оченьбольшие молекулы ДНК. TEL, CEN и ORI — это последовательности теломеры, центромеры и точки началарепликации соответственно дрожжей Saccharomyces cerevisiae; все эти участки необходимы для размножения YAC. BamH1 и EcoRI — это сайты, по которым соответствующие рестриктазы расщепляют двойнуюспираль ДНК.
Последовательности, обозначенные A и B, кодируют ферменты, служащие селективнымимаркерами для упрощения идентификации дрожжевых клеток, содержащих искусственную хромосому.Поскольку бактерии делятся быстрее, чем дрожжи, в настоящее время в большинстве широкомасштабных проектов по клонированию для амплификации ДНК используют E. coli. (Адаптировано из D. T. Burke,G. F. Carle and M. V. Olson, Science 236: 806–812, 1987. С любезного разрешения издательства AAAS.)954Часть III.
Методыподдерживать крупные клонированные последовательности ДНК: при наличиивсего нескольких BAC вероятность нарушения клонированных фрагментов ДНКпри рекомбинации с другими копиями плазмиды очень мала. Благодаря их стабильности, способности принимать большие участки ДНК и простоте в обращениибактериальные искусственные хромосомы стали предпочтительными векторамидля создания библиотек ДНК сложных организмов, включая геномные библиотекичеловека и мыши.8.4.7. Два типа библиотек ДНК служат различным целямРасщепление целого генома клетки специфической рестриктазой и клонирование каждого фрагмента, как описано выше, приводит к образованию очень большогочисла фрагментов ДНК — порядка миллиона в случае генома млекопитающих.Фрагменты распределены среди миллионов различных колоний бактериальныхклеток, претерпевших трансфекцию.
В BAC, в отличие от типичных плазмид,можно вставлять бóльшие фрагменты, поэтому для охвата всего генома требуетсяменьше бактериальных клеток. В любом случае, каждая колония состоит из клонаклеток, произошедших из единственнойклетки-предшественника, и поэтому каждая колония содержит множество копийопределенного участка фрагментированного генома (рис. 8.42). Такая плазмидасодержит клон геномной ДНК, а полныйнабор плазмид называется библиотекойгеномной ДНК. Но поскольку геномнаяДНК разрезается на фрагменты случайным образом, только некоторые фрагменты содержат гены.
Многие клоны геномной ДНК, полученные из ДНК высшихэукариотических клеток, содержат тольконекодирующую ДНК, которая, как показано в главе 4, составляет большую частьтаких геномов.Альтернативный подход состоитв выборе перед началом процесса клонирования только тех последовательностей,которые транскрибируются в мРНК и,таким образом, соответствуют генам, кодирующим белки. С этой целью из клеток выделяют мРНК и затем синтезируютРис.
8.42. Создание библиотеки человеческой геномной ДНК. Геномные библиотеки обычно поддерживают в популяции бактерий. Каждая бактериянесет какой-то один фрагмент человеческой ДНК.Для простоты показано клонирование только нескольких показательных (изображены цветом)фрагментов. В реальности будут клонированы и всесерые участки ДНК.Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 955копию ДНК каждой присутствующей мРНК. Такие молекулы ДНК называютсякомплементарными ДНК, или кДНК.
Реакция копирования катализируется обратной транскриптазой ретровирусов, которая синтезирует комплементарную цепьДНК на цепи РНК. Одноцепочечные молекулы кДНК, синтезированные обратнойтранскриптазой, становятся двухцепочечными за счет действия ДНК-полимеразы,и уже такие молекулы кДНК вводят в плазмидный или вирусный вектор и клонируют (рис.
8.43). Каждый полученный таким методом клон называется клономкДНК, а весь набор клонов, полученных из единократного выделения мРНК, составляет библиотеку кДНК.На рис. 8.44 показаны некоторые важные различия между клонами геномнойДНК и клонами кДНК. Геномные клоны представляют собой случайный набор всехпоследовательностей ДНК организма, и, за редким исключением, они одинаковывне зависимости от типа клеток, из которых их получают.
Наоборот, клоны кДНКсодержат только те участки генома, которые были транскрибированы в мРНК. Поскольку клетки различных тканей синтезируют различные наборы молекул мРНК,для каждого типа клеток получают различные библиотеки кДНК.8.4.8. Клоны кДНК содержат непрерывные кодирующие последовательностиИспользование библиотек кДНК для клонирования генов имеет несколькопреимуществ.
В первую очередь специализированные клетки синтезируют некоторые белки в больших количествах. В этом случае, кодирующие белок мРНК скореевсего будут содержаться в клетке в таком объеме, что полученная из этих клетокбиблиотека кДНК будет обогащена молекулами кДНК, кодирующими данныйбелок, что значительно облегчает задачу идентификации нужного клона в библиотеке (см. рис.
8.44). Гемоглобин, например, в больших количествах синтезируетсяв развивающихся эритроцитах (красных кровяных тельцах); именно поэтому геныглобинов клонировали одними из первых.Наиболее важным преимуществом клонов кДНК является тот факт, что онисодержат непрерывную кодирующую последовательность гена.
Как мы видели,гены эукариот обычно состоят из коротких кодирующих последовательностейДНК (экзонов), отделенных друг от друга значительно более длинными некодирующими последовательностями (интронами); синтез мРНК включает в себяудаление некодирующих последовательностей из исходного транскрипта РНКи склеивание (сплайсинг) кодирующих последовательностей. Ни в бактериальной, ни в дрожжевой клетках РНК, полученная из гена высшей эукариотическойклетки, не будет претерпевать таких модификаций. Таким образом, когда цельюклонирования является расшифровка аминокислотной последовательности белкаиз последовательности ДНК или получение белка в больших количествах путемэкспрессии клонированного гена в бактериальной или дрожжевой клетке, предпочтительнее начинать с кДНК.
Библиотеки кДНК обладают дополнительнымиприменениями: как описано в главе 7, многим мРНК человека и других сложныхорганизмов свойственен альтернативный сплайсинг, и библиотека кДНК зачастуюсодержит большинство, если не все, альтернативные варианты мРНК, содержащиесяв данной клеточной линии или ткани.Геномные библиотеки и библиотеки кДНК — это неисчерпаемые ресурсы,которыми исследователи делятся между собой. Сегодня многие такого рода библиотеки доступны из коммерческих источников.956Часть III.
МетодыРис. 8.43. Синтез кДНК. Из ткани выделяют всю мРНК, и фермент обратная транскриптаза синтезируеткомплементарные к молекулам РНК молекулы ДНК (кДНК) (см. стр. 320). Для простоты показано копирование в ДНК только одной такой мРНК. Сначала короткий олигонуклеотид, служащий праймеромдля обратной транскриптазы, гибридизуется с комплементарным поли(А)-хвостом на 3´-конце мРНК (см.главу 6). Затем обратная транскриптаза копирует РНК в комплементарную цепь ДНК, образуя гибриднуюдвойную спираль ДНК/РНК. Обработка гибрида ДНК/РНК ферментом рибонуклеазой H (см.
рис. 5.12)приводит к образованию разрывов и пропусков в цепи РНК. Затем фермент ДНК-полимераза копируетоставшуюся одноцепочечную кДНК с образованием двойной спирали кДНК. Праймером этой реакциисинтеза служит участок исходной мРНК. Поскольку ДНК-полимераза, используемая для синтеза второйцепочки ДНК, может работать через связанные молекулы РНК, участок РНК, основания которого с 3´-концаспарены с первой цепочкой ДНК, обычно служит праймером для конечного продукта синтеза второйцепи. Эта РНК впоследствии деградирует при клонировании. В результате нуклеотидные последовательности с 5´-концов исходных молекул мРНК часто отсутствуют в библиотеках кДНК.8.4.9. Гены можно селективно амплифицировать с помощью полимеразной цепной реакцииСейчас, когда доступно огромное количество геномных последовательностей,гены могут быть клонированы напрямую без предварительного создания библиотекиГлава 8.
Манипуляция белками, ДНК и РНК 957Рис. 8.44. Различия между клонами кДНК и геномной ДНК, полученными из одного участка ДНК.В данном примере ген A транскрибируется редко, тогда как ген B — часто. Оба гена содержат интроны(зеленые). В библиотеке геномной ДНК в клоны будет включена как интронная, так и нетранскрибируемаяДНК (розовая). Причем большинство клонов содержат только часть кодирующей последовательностигена (красная). В клонах кДНК последовательности интронов (желтые) удалены в результате сплайсинга во время формирования мРНК (голубая), и поэтому в каждом клоне содержится непрерывнаякодирующая последовательность.
Поскольку ген B в клетках, из которых получают библиотеку кДНК,транскрибируется чаще, чем ген A, он и встречается в библиотеке гораздо чаще. В библиотеке геномнойДНК гены A и B будут содержаться в одинаковом количестве.ДНК. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) сделал возможным быстроеклонирование. Взяв целый геном, ПЦР позволяет амплифицировать ДНК выбранного участка в миллиарды раз, эффективно «очищая» данную ДНК от остальногогенома.Сначала химическими методами синтезируют пару олигонуклеотидов ДНК,прилегающих с двух сторон к нужной нуклеотидной последовательности гена. Этиолигонуклеотиды затем используют в качестве праймеров синтеза ДНК на одиночныхцепях, полученных путем нагревания ДНК всего генома.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
