Часть 3 (1129751), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Заново синтезированнуюДНК получают в реакции, катализируемой in vitro очищенной ДНК-полимеразой,и праймеры остаются на 5´-концах конечных фрагментов ДНК (рис. 8.45, а).Во время первого цикла синтеза ДНК ничего особенного не получается; силаметода ПЦР раскрывается только через несколько повторений цикла синтеза ДНК.Каждый цикл удваивает количество синтезированной в прошлом цикле ДНК. По-958Часть III. МетодыРис. 8.45. Амплификация ДНК при помощи метода ПЦР. Знание последовательности ДНК, которуюнеобходимо амплифицировать, позволяет создать два синтетических олигонуклеотида ДНК.
Одинпраймер комплементарен последовательности на одной цепи двойной спирали ДНК, а второй — последовательности на другой цепи, но с противоположного конца участка, который нужно размножить.Эти олигонуклеотиды служат в качестве праймеров для синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразойin vitro, и они определяют участок ДНК, который будет амплифицирован. (а) ПЦР начинается с дцДНК,и в начале каждого цикла происходит краткое нагревание для разделения цепей (шаг 1). После разделения цепей охлаждение ДНК в присутствии избытка олигонуклеотидных праймеров позволяетпроизойти гибридизации этих праймеров с комплементарными последовательностями на двух цепях ДНК(шаг 2). Затем смесь инкубируют с ДНК-полимеразой и четырьмя дезоксирибонуклеозидтрифосфатамидля синтеза ДНК, начинающегося с двух праймеров (шаг 3).
Затем цикл повторяют, начиная с нагреваниядля разделения цепей синтезированной ДНК. (б) По мере того как процесс повторяют снова и снова,новые синтезированные фрагменты служат шаблонами для следующего цикла, и через несколько циклов преимущественная ДНК идентична последовательности, ограниченной и включающей в себя двапраймера исходного шаблона. Из ДНК, с которой началась исходная реакция, амплифицируется толькопоследовательность, заключенная между двумя праймерами, поскольку к другим участкам праймеровнет.
В приведенном примере (б) три цикла реакции дают 16 цепей ДНК, 8 из которых (заключенныев желтые прямоугольники) обладают такой же длиной и в точности совпадают с одной из цепей исходной ограниченной последовательности, показанной слева; остальные цепи содержат сбоку от исходной последовательности дополнительную ДНК, реплицируемую в нескольких первых циклах. Послееще четырех циклов 240 из 256 цепей ДНК будут в точности соответствовать исходной ограниченнойпоследовательности, а еще через несколько циклов, практически все молекулы ДНК будут обладатьтакой уникальной длиной.Глава 8.
Манипуляция белками, ДНК и РНК 959скольку каждый цикл требует краткого нагревания для разделения цепей двойнойспирали ДНК, необходимо использование специальной ДНК-полимеразы, котораяне будет денатурировать при нагревании. Такую ДНК-полимеразу выделяют из термофильных бактерий, и она устойчива к значительно более высоким температурам,чем обычные белки. С каждым новым циклом синтеза ДНК новые фрагментыслужат шаблонами для следующих, и через несколько циклов преимущественнымпродуктом реакции будет один вид ДНК, чья длина соответствует расстояниюмежду двумя исходными праймерами (см. рис.
8.45, б).На практике эффективная амплификация ДНК требует 20–30 реакционныхциклов, продукты каждого цикла служат шаблонами ДНК для следующего — отсюда термин полимеразная «цепная реакция». На прохождение одного цикла затрачивается всего около 5 минут, и весь процесс можно легко автоматизировать.Таким образом, ПЦР делает возможным «бесклеточное молекулярное клонирование»фрагмента ДНК за несколько часов, тогда как для стандартного клонированиятребуется несколько дней. Этот метод в настоящее время повсеместно используютдля прямого клонирования ДНК интересующих генов, когда исходным материаломслужит либо геномная ДНК, либо выделенная из клеток мРНК (рис.
8.46).Метод ПЦР очень чувствителен; он позволяет обнаружить одну единственнуюмолекулу ДНК в образце. Точно так же можно анализировать следовые количестваРНК, предварительно транскрибировав их в ДНК при помощи обратной транскриптазы. Метод клонирования ПЦР в значительной мере вытеснил Саузерн-блоттингиз областей диагностики генетических заболеваний и низкого уровня вируснойинфекции. Также он подает большие надежды в области судебно-медицинскойэкспертизы, где его можно использовать для анализа мельчайших следов кровии других тканей, даже на уровне одной клетки, и идентификации человека, комуэтот образец принадлежал, при помощи его или ее генетического «отпечатка пальца» (рис. 8.47).8.4.10. Клетки как фабрики по производству специфических белковОсновная часть из тысяч различных белков — сюда входят и белки, выполняющие важнейшие ключевые функции, — присутствует в клетке в очень маленькихколичествах.
Раньше было очень сложно, если вообще возможно, получить болеенескольких микрограммов чистого белка. Возможно, наиболее важным вкладомклонирования ДНК и генной инженерии в молекулярную биологию стало то, чтоони позволили получать любой белок клетки в практически неограниченном количестве.Большие количества нужного белка получают в живых клетках при помощивекторов экспрессии (рис.
8.48). Обычно это плазмиды, созданные для получениябольших количеств стабильной мРНК, которую можно эффективно транслировать в белок в претерпевших трансфекцию клетках бактерий, дрожжей, насекомых или млекопитающих. Чтобы высокое содержание чужеродного белка не мешало росту клетки,вектор экспрессии часто создают таким образом, чтобы синтез чужеродной мРНКи белка начинался незадолго до того, как клетки собирают и лизируют (рис. 8.49).Поскольку нужный белок, получаемый при помощи вектора экспрессии, синтезируется внутри клетки, после лизиса клеток его необходимо очистить от белковклетки-хозяина при помощи хроматографии.
Но поскольку в клеточном лизатеэтого белка содержится в избытке (часто 1–10 % от всего белка клетки), очисткулегко осуществить всего за несколько шагов. Как показано выше, многие векторы960Часть III. МетодыРис. 8.46. Получение геномного клона или клона кДНК с помощью полимеразной цепной реакции.(а) Чтобы получить геномный клон, сначала из клеток выделяют хромосомную ДНК. Затем добавляютпраймеры для ПЦР, фланкирующие клонируемый участок ДНК, и проводят много циклов реакции (см.рис. 8.45). Поскольку амплифицируется только ДНК, заключенная между (и содержащая) праймеры, ПЦРпозволяет селективно получить короткие участки хромосомной ДНК в чистом виде.
(б) Для того чтобыиспользовать ПЦР для получения клона кДНК гена, сначала из клеток выделяют мРНК. Затем к смесимРНК добавляют первый праймер, и обратная транскриптаза синтезирует комплементарную цепь ДНК.После этого добавляют второй праймер, и одноцепочечная молекула кДНК амплифицируется в последовательных циклах ПЦР, как показано на рис. 8.45. В обоих типах клонирования необходимо заранеезнать нуклеотидную последовательность по крайней мере части клонируемого фрагмента.экспрессии содержат молекулярный маркер — кластер гистидиновых остатков илималенький маркерный белок — в экспрессируемом белке, что облегчает очисткупри помощи аффинной хроматографии (см.
рис. 8.16). Сейчас доступны разнообразные векторы экспрессии, каждый из которых разработан для определеннойклетки, в которой будет производиться белок. Таким образом, клетки можно заставить синтезировать большие количества полезных для медицины белков, например человеческого инсулина и гормона роста, интерферона и вирусных антигеновГлава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 961к вакцинам. В более общем случае эти методы позволяют производить в большихколичествах любой белок, даже такой, который в клетке содержится только в нескольких копиях, для детальных структурных и функциональных исследований,методы которых мы обсудили ранее.Методы работы с ДНК также позволяют получать большие количества любоймолекулы РНК при условии, если ее ген выделен.
Исследования сплайсинга РНК,синтеза белков и основанных на РНК ферментов (рибозимов) значительно упрощаются благодаря доступности чистых молекул РНК. Большинство РНК в клеткесодержатся в очень маленьких количествах, и их очень сложно очистить от других клеточных компонентов, особенно от десятков тысяч других присутствующихв клетке РНК. Но любую интересующую РНК можно синтезировать в достаточныхколичествах in vitro путем транскрипции ее последовательности ДНК (полученнойописанными только что методами) высокоэффективной вирусной РНК-полимеразой.Полученный в результате единственный вид РНК легко отделить от ДНК и РНКполимеразы.8.4.11. Белки и нуклеиновые кислоты можно синтезироватьнапрямую в химических реакцияхДля прямого синтеза специфических последовательностей аминокислот и нуклеиновых кислот разработаны специальные химические реакции. Эти методыпредставляют собой прямой источник биологических молекул и не требуют использования клеток или ферментов.
Химический синтез предпочтителен для получения нуклеиновых кислот длиной до 100 нуклеотидов, что особенно полезнодля описанных выше основанных на ПЦР методов. Его также широко используютдля создания специфических пептидов, которые при химическом спаривании с другими белками позволяют получать антитела против пептида.8.4.12. ДНК можно быстро секвенироватьМетоды, позволяющие быстро и легко определять нуклеотидную последовательность любого фрагмента ДНК, сделали возможной расшифровку последовательностей ДНК десятков тысяч генов и множества полных геномов (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
