Часть 3 (1129751), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Различные мутации в этом пути приводят к не наблюдающейсяв норме аккумуляции белков в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) или аппаратеГольджи. Когда создают клетку дрожжей, несущую мутацию, блокирующую процессинг белков в ЭР и мутацию, блокирующую процессинг в аппарате Гольджи,белки скапливаются в ЭР. Это указывает на то, что до секреции белки должныпройти через ЭР, прежде чем они будут отправлены в аппарат Гольджи (рис. 8.57).Строго говоря, эпистаз может дать информацию о порядке генов в метаболическомпути только в том случае, если обе мутации являются нулевыми аллелями.
Когдамутации частично восстанавливают свою функцию, их эпистатические взаимоотношения интерпретировать сложно.Иногда двойной мутант может показать новый или более поврежденный фенотип по сравнению с любым из одиночных мутантов. Такой тип генетическоговзаимодействия называется синтетическим фенотипом, и если фенотип приводитк гибели организма, то он называется синтетической леталью. В большинствеслучаев синтетический фенотип указывает на то, что два гена работают в двух разных параллельных путях, каждый из которых способен опосредовать один и тот жеклеточный процесс. Таким образом, когда в двойном мутанте оба пути изменены,процесс полностью нарушается и наблюдается синтетический фенотип.8.5.6. Гены, идентифицированные посредством мутаций, можноклонироватьСледующий шаг после получения в генетическом скрининге мутантных организмов — идентификация гена или генов, ответственных за измененный фенотип.Рис.
8.57. Использование генетики для определения порядка функционирования генов. В нормальныхклетках секретируемые белки погружаются в пузырьки, которые сливаются с плазматической мембранойи выбрасывают свое содержимое во внешнюю среду. Два мутанта, A и B, не способны секретироватьбелки. В мутанте A секреторные белки скапливаются в ЭР, в мутанте B секреторные белки — в аппаратеГольджи, а в двойном мутанте AB белки — в ЭР. Это говорит о том, что в секреторном пути дефектныйген мутанта A работает до дефектного гена мутанта B.Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 979Если фенотип создан путем инсерционного мутагенеза, определить положение нарушенного гена довольно просто.
Фрагменты ДНК, содержащие вставку (например, транспозон или ретровирус), выделяют, амплифицируют при помощи ПЦРи расшифровывают нуклеотидную последовательность фланкирующей ДНК. Затемможно провести поиск по геномным базам данных открытых рамок считывания,содержащих эту фланкирующую последовательность.Если для создания мутаций использовали повреждающее ДНК химическоесоединение, задача идентификации инактивированного гена усложняется, но ееможно решить несколькими способами. В одном из них первым шагом являетсяэкспериментальное определение локализации гена в геноме. Для картирования нового гена сначала оценивают, как далеко он лежит от известных генов.
Это дает егопримерное положение на хромосоме. Оценку расстояния между генными локусамиобычно производят путем анализа групп сцепления. Этот метод основан на том,что близко лежащие в хромосоме гены имеют тенденцию наследоваться вместе.Однако даже расположенные рядом гены могут быть разделены при рекомбинациив мейозе. Чем больше расстояние между локусами генов, тем больше вероятностьтого, что они будут разделены при кроссинговере (см. приложение 8.1).
Расчетчастоты рекомбинации между двумя генами дает примерное расстояние междуними. Если положение в геноме одного гена известно, то тогда можно оценитьположение другого.Поскольку гены не всегда локализованы настолько близко друг к другу, чтоможно точно указать их локализацию, для оценки положения неизвестного генав анализе групп сцепления часто используются физические маркеры, расположенныевдоль генома. Этими маркерами обычно служат короткие нуклеотидные участкис известными последовательностями и локализацией в геноме, существующиепо крайней мере в двух аллельных формах. Наиболее простыми маркерами служатоднонуклеотидные полиморфизмы (Single-Nucleotide Polymorphism, SPN; на русском научном сленге их иногда называют «снипами»), короткие последовательности, различающиеся у особей популяции на одну нуклеотидную пару.
SNP могутбыть обнаружены при помощи методов гибридизации. Для различных организмовнайдено множество таких физических маркеров, распределенных по всей длинехромосом. Если эти маркеры расположены достаточно плотно, анализ групп сцепления, направленный на поиск совместного наследования одного или несколькихSNP с мутантным фенотипом, позволяет свести потенциальную локализацию генак области хромосомы, содержащей всего несколько последовательностей генов. Затем напрямую исследуют структуру и функцию этих генов и определяют, которыйиз них ответственен за исходный мутантный фенотип.8.5.7. Генетика человека обладает особыми задачами и возможностямиНесмотря на то что генетические эксперименты на людях считаются неэтичными и запрещены законом, люди страдают от большого количества генетическихзаболеваний.
Описанный выше анализ групп сцепления может быть использовандля идентификации генов, ответственных за такие наследственные состояния. Такогорода исследования требуют образцов ДНК большого количества семей, страдающих одним наследственным заболеванием. Эти образцы исследуют на присутствиефизических маркеров, например SNP, которые могут быть тесно сцеплены с геном980Часть III. Методызаболевания, то есть наследоваться всеми больными людьми, но не их здоровымиродственниками. Затем ген заболевания локализуют, как описано выше (рис. 8.58).Например, так открыты гены муковисцидоза и болезни Хантингтона.Отметим, что яйцеклетка или сперматозоид будут передавать от родителяребенку только одну из пары хромосом.8.5.8. Гены человека наследуются гаплотипными блоками, что помогает в поиске мутаций, вызывающих болезниОбладая полной последовательностью человеческого генома, сейчас мы можемизучать генетику человека способами, недоступными еще несколько лет назад.
Например, мы можем начать идентифицировать различия ДНК, благодаря которымодин человек отличается от другого. Не существует двух людей (за исключениемРис. 8.58. Анализ групп сцепления при помощи физических маркеров ДНК для нахождения гена у человека. Показано сцепленное наследование специфического человеческого фенотипа (здесь — генетического заболевания) с маркером SNP. Если люди, наследующие болезнь, также почти всегда наследуютмаркер SNP, то вызывающий заболевание ген и SNP, скорее всего близко расположены в хромосоме,как показано на рисунке.
Чтобы доказать статистическую достоверность наблюдаемого сцепления,необходимо протестировать сотни людей. Отметим, что сцепление будет абсолютным только в томслучае, если маркер SNP расположен в самом гене. Таким образом, SNP иногда будет отделен от геназаболевания при кроссинговере в мейозе во время формирования яйцеклетки или сперматозоида: этотслучай показан в самой правой паре хромосом.
При работе с секвенированным геномом процедурубудут повторять с SNP, расположенными по обеим сторонам от исходного SNP, до тех пор, пока не будетнайдено абсолютное сцепленное наследование.Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 981однояйцевых близнецов) с одинаковым геномом. Каждый из нас несет набор полиморфизмов — различий в нуклеотидной последовательности, — которые делаютнас уникальными.
Эти полиморфизмы можно использовать в качестве маркеровдля создания генетических карт и проведения генетического анализа для соотнесения определенных полиморфизмов со специфическими заболеваниями илипредрасположенностью к ним.Проблема состоит в том, что нуклеотидные последовательности двух людейобычно различаются на 0,1 % (примерно одно различие на 1 000 п. н.). Это дает3 миллиона различий между двумя людьми. Теоретически для идентификации одного или двух таких полиморфизмов, ответственных за наследственную болезнь илипредрасположенность к ней, необходимо просмотреть 3 миллиона полиморфизмов.Чтобы сократить количество работы, исследователи используют недавнее открытиетого факта, что человеческие гены наследуются блоками.Человеческий вид относительно молод, и считается, что мы произошли от относительно небольшой популяции людей, живших в Африке 10 тысяч лет назад.Поскольку всего несколько сотен поколений отделяют нас от этой праотеческойпопуляции, большие участки человеческих хромосом перешли от родителей ребенку не тронутыми происходящей в мейозе рекомбинацией.
На самом деле мывидим, что определенные наборы аллелей (включая SNP) наследуются в пределаххромосом крупными блоками. Предковые участки хромосом — наборы аллелей,наследовавшиеся от поколения к поколению кластерами с незначительными генетическими изменениями, — называются гаплотипными блоками. Как и гены, SNPи другие генетические маркеры, существующие в различных аллельных формах,гаплотипные блоки также имеют всего несколько разновидностей, свойственныхчеловеческой популяции, каждая из которых представляет собой комбинацию аллелей, унаследованную от общего предка много сотен лет назад.В настоящее время исследователи создают карту человеческого генома, основанную на этих гаплотипных блоках, носящую название карты гаплотипов (haplotypemap – hapmap).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
