Часть 3 (1129751), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Помещая ген под контроль индуцируемого промотора, можно включатьи выключать его в любой момент, наблюдая вызываемые этим эффекты. Индуцируемые промоторы, работающие только в определенной ткани, можно использоватьдля исследования влияния активации (или инактивации) гена только в этой ткани.Наконец, доминантно-негативные мутации часто применяют в случае организмов,для которых введение нового измененного гена в геном проще, чем замена уже существующих.
В доминантно-негативном подходе используется тот факт, что большинствобелков функционирует в составе больших белковых комплексов. Включение всегоодного нефункционирующего компонента часто инактивирует такие комплексы. Такимобразом, конструируя ген, дающий большие количества неактивного, но способноговстроиться в комплекс мутантного белка, часто получают клетки, в которых комплексыне функционируют даже в присутствии нормального белка (рис.
8.62).При обсуждении классической генетики мы отмечали, если белок необходимдля выживания клетки (или организма), то доминантно-негативный мутант будетнежизнеспособным. В результате функцию белка установить будет невозможно.Чтобы эта проблема не возникала в обратной генетике, можно сцепить мутантныйген с индуцируемым промотором.
Это позволит синтезировать дефектный продуктгена только «по команде», например, в ответ на повышение температуры или в присутствии определенной сигнальной молекулы.При изучении работы гена и кодируемого имбелка не всегда нужно производить серьезные изменения, такие как забивание клетки огромнымиколичествами белка или полное удаление продуктагена. Иногда полезно делать небольшие измененияв белковой структуре, позволяющие начать анализировать, какие части белка важны для его функционирования. Активность фермента, например,можно исследовать путем изменения единственнойРис. 8.61. Эктопическая неправильная экспрессия Wnt, сигнального белка, влияющего на формирование оси тела в ранних эмбрионах Xenopus.
В данном эксперименте мРНК, кодирующуюWnt, ввели в вентральный вегетативный бластомер, что привелок формированию второй оси тела (см. главу 22). (Из S. Sokol et al.,Cell 67: 741–752, 1991. С любезного разрешения Elsevier.)986Часть III. МетодыРис. 8.62. Доминантно-негативное действие белка. Создан кодирующий мутантный белок ген, которыйпрепятствует нормальным копиям того же белка выполнять свои функции. В приведенном простом примере нормальный белок становится активным только в составе комплекса, а мутантный белок блокируетфункцию, формируя смешанный неактивный комплекс. Таким образом, единственная копия мутантногогена в любом месте генома способна инактивировать нормальные продукты других копий гена.аминокислоты в его активном сайте.
Для такой тонкой перестройки генов (и, следовательно, их белковых продуктов) необходимы специальные методы. Первымшагом часто бывает химический синтез короткой молекулы ДНК, содержащейнужный измененный участок нуклеотидной последовательности гена. Эту синтетическую олигонуклеотидную ДНК гибридизуют с одноцепочечной плазмиднойДНК, содержащей последовательность, которую необходимо изменить. Условиягибридизации позволяют спаривание частично комплементарных цепей ДНК.
Синтетический олигонуклеотид станет праймером для синтеза ДНК ДНК-полимеразой.В результате получится двойная спираль ДНК, несущая в одной из цепей измененную последовательность. После трансфекции получают плазмиды, содержащиеполностью модифицированную последовательность гена. Затем измененную ДНКвводят в вектор экспрессии, чтобы перестроенный белок синтезировать в соответствующем типе клеток и подробно исследовать его функцию. Такой метод изменения аминокислотных остатков в белке, носящий название сайт-направленногомутагенеза, позволяет точно определить, какие участки полипептидной цепи играютключевую роль в сворачивании белков, их взаимодействии с другими молекуламиили в ферментативном катализе (рис. 8.63).8.5.12. Модифицированные гены можно вводить в зародышевыелинии многих организмовИзмененные гены можно доставить в клетки несколькими способами.
ДНКможно вводить в клетки млекопитающих путем микроинъекции стеклянной микропипеткой или через вирус, несущий чужеродные гены. В клетки растений гены частовводят методом бомбардировки частицами: образцы ДНК наносят на маленькиезолотые гранулы, которыми затем в прямом смысле выстреливают из специальномодифицированного пистолета, пробивая клеточную стенку.
Электропорация — этопреимущественный метод введения ДНК в бактерии и некоторые другие клетки.В данном подходе короткий электрический разряд временно делает клеточнуюмембрану проницаемой, позволяя чужеродной ДНК приникнуть в цитоплазму.В отличие от высших эукариот (многоклеточных и диплоидных), бактерии,дрожжи и клеточный слизевик Dictyostelium обычно существуют в виде гаплоидныхГлава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 987Рис. 8.63. Использование синтетических олигонуклеотидов для модификации кодирующего белокучастка гена методом сайт-направленного мутагенеза. (а) Рекомбинантная плазмида, содержащаявставку гена, разделяется на две цепи ДНК.
Синтетический олигонуклеотидный праймер, комплементарный части последовательности гена, но содержащий один измененный нуклеотид в определеннойточке, добавляют к одноцепочечной ДНК в условиях, допускающих неидеальную гибридизацию (см.рис. 8.36). (б) Праймер гибридизуется с ДНК, создавая одну некомплементарную нуклеотидную пару.(в) Рекомбинантную плазмиду делают двухцепочечной путем синтеза ДНК in vitro (начиная с праймера) и последующего сшивания разрывов ДНК-лигазой. (г) Двухцепочечную ДНК вводят в клетку, гдеона реплицируется. Репликация, использующая одну из цепей в качестве шаблона, дает нормальнуюмолекулу ДНК, но репликация с другой цепью (той, которая содержит праймер) дает молекулу ДНК,несущую нужную мутацию.
Только половина клеток-потомков будет содержать плазмиду с нужныммутантным геном. Однако клетку-потомка, обладающую мутантным геном, можно идентифицировать,отделить от остальных клеток и культивировать для получения чистой популяции клеток, несущих мутацию.
Показано только одно изменение, которое можно создать при помощи данного метода. При помощи олигонуклеотидов с соответствующей последовательностью можно за раз делать больше однойаминокислотной замены, а также вставлять или удалять одну или несколько аминокислот. На рисункене показано, но можно создавать сайт-специфические мутации при помощи соответствующих олигонуклеотидов и ПЦР для амплификации мутантного гена (вместо репликации плазмид).988Часть III. Методыодиночных клеток.
В этих организмах искусственно введенная молекула ДНК, несущая мутантный ген, с относительно большой частотой может заменить единственнуюкопию нормального гена путем гомологичной рекомбинации; следовательно, легкополучают клетки, в которых нормальный ген заменен на мутантный (рис.
8.64, а).Таким образом, можно создавать клетки, у которых отсутствует определенный белок или синтезируется его альтернативная форма. Возможность проводить прямуюзамену генов в низших эукариотах в сочетании с эффективностью стандартныхметодов генетического анализа в этих гаплоидных организмах в значительной степени объясняет, почему исследования этих типов клеток так важны для пониманиямеханизмов клеточных процессов, свойственных всем эукариотам.8.5.13. Можно изменять геном животныхТакже возможно добавлять и заменять гены в животных и растениях, но методология в этом случае сложнее.
Животные и растения, генетически модифицированные посредством вставки, удаления или замещения генов, называют трансгеннымиорганизмами, а любые чужеродные или измененные гены — трансгенами. Мысконцентрируем наше внимание на трансгенных мышах, так как в этой областидостигнут огромный прогресс. Если молекулу ДНК, несущую мутантный мышиныйген, перенести в клетку мыши, она обычно встраивается в хромосому случайнымобразом, но примерно один раз из тысячи она замещает одну или две копии нормального гена путем гомологичной рекомбинации. Пользуясь этими редкими случаями направленного воздействия на гены, любой конкретный ген в клетке мышиможно путем прямой замены изменить или инактивировать.
В таком особом случае,когда обе копии интересующего гена полностью инактивированы или удалены, получившихся животных называют «нокаутными» мышами.Рис. 8.64. Замена, нокаут и добавление генов. Для создания трансгенного организма нормальный генможно изменить несколькими способами. (а) Нормальный ген (зеленый) может быть полностью замещен его мутантной копией (красная). Это позволяет получить информацию об активности мутантногогена без вмешательства нормального гена, и, следовательно, можно наблюдать эффекты маленькихмутаций. (б) Нормальный ген можно полностью инактивировать, например, сделав в нем большуюделецию. (в) Мутантный ген можно просто добавить в геном.
Для некоторых организмов это самыйпростой в исполнении тип генетической инженерии. Такой подход может дать полезную информациюв случае, когда введенный мутантный ген подавляет функционирование нормального гена, например,при доминантно-негативной мутации (см. рис.
8.62).Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 989Метод заключается в следующем. На первом этапе фрагмент ДНК, содержащиймутантный ген (или фрагмент ДНК, направленный на нарушение последовательности гена-мишени), вводят в вектор, а затем в культивируемые ЭС клетки (см.рис. 8.5), способные давать клетки различных типов. После периода клеточнойпролиферации выделяют редкие колонии клеток, в которых, вероятно, произошлагомологическая рекомбинация, приведшая к замене гена. Правильные колонииотбирают методами ПЦР или Саузерн-блоттинга: они будут содержать рекомбинантные последовательности ДНК, в которых введенный фрагмент частично илиполностью заменил одну копию нормального гена. На втором этапе отдельные ЭСклетки отобранной колонии помещают в тонкую микропипетку и вводят в раннийэмбрион мыши.
Претерпевшие трансфекцию ЭС клетки взаимодействуют с клеткамиэмбриона-хозяина, что приводит к формированию нормально выглядящей мыши;некоторые части таких химерных животных, включая, если повезет, клетки зародышевой линии, часто развиваются из модифицированных ЭС клеток (рис. 8.65).Мышей с трансгеном в их зародышевой линии затем разводят для получениясамки и самца, гетерозиготных по замене гена (то есть они несут одну нормальнуюи одну мутантную копию гена).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
