Часть 3 (1129751), страница 25
Текст из файла (страница 25)
При скрещивании этих двух мышей одна четвертаячасть их потомства будет гомозиготна по модифицированному гену. Изучение такихгомозигот позволяет исследовать функционирование измененного гена или влияниеинактивации гена в отсутствие соответствующего нормального гена.Возможность создавать трансгенных мышей, у которых отсутствует нормальныйген, стала прорывом. Сейчас метод используют для определения функций всех мышиных генов (рис. 8.66). Для создания условных мутантов, у которых функционированиеинтересующего гена нарушено в определенной ткани в конкретный момент развития,применяют специальные методы. Подход основан на сайт-специфическом вырезании —и, следовательно, удалении — системой рекомбинации гена-мишени в определенномместе или в определенное время.
Наиболее распространена система рекомбинации,называющаяся Cre/lox, которая широко используется для замены генов в мышахи растениях (см. рис. 5.79). В данном случае ген-мишень в ЭС клетке заменяетсяна полностью функциональную версию гена, фланкированную парой коротких последовательностей ДНК, называемых lox-сайтами и узнаваемых белком рекомбиназой Cre.Получающиеся в результате трансгенные мыши обладают нормальным фенотипом. Ихскрещивают с трансгенными мышами, у которых экспрессируется ген рекомбиназы Creпод контролем индуцируемого промотора.
В определенных клетках или тканях, в которых включают Cre, она катализирует рекомбинацию между lox-последовательностями,вырезая ген-мишень и инактивируя его. Сходные системы рекомбинации используютдля создания условных мутаций в Drosophila (см. рис. 22.49).Если исходная модификация гена полностью инактивирует его функцию, тотаких гомозиготных мышей называют нокаутными. Когда у таких мышей отсутствуют гены, функционирующие во время развития, они часто погибают задолгодо достижения зрелости.
Такие летальные дефекты подробно изучают для определения нормальной функции отсутствующего гена.8.5.14. Трансгенные растения играют важную роль как в клеточнойбиологии, так и в сельском хозяйствеПоврежденное растение часто может восстановить себя при помощи процесса,во время которого зрелые дифференцированные клетки «дедифференцируются»,990Часть III.
МетодыРис. 8.65. Методы, используемые для замены генов в мышах. На первом этапе (а) модифицированнуюверсию гена вводят в культивируемые ЭС клетки. Лишь в нескольких редких ЭС клетках соответствующие нормальные гены будут заменены на ген, измененный в процессе гомологичной рекомбинации.Несмотря на трудоемкость процедуры, эти редкие клетки можно идентифицировать и культивироватьдля получения множества потомков, каждый из которых будет нести один мутантный ген вместо однойиз двух копий соответствующего нормального гена. На следующем этапе (б) эти модифицированные ЭСклетки вводят в очень ранний мышиный эмбрион. Клетки вживляются в растущий зародыш, и некоторыесоматические клетки (показаны оранжевым) полученной в результате мыши будут нести измененныйген. Некоторые из этих мышей также будут содержать клетки зародышевой линии с модифицированнымгеном; при скрещивании с нормальной мышью часть потомства будет нести одну копию измененногогена во всех своих клетках.
Если скрестить двух таких мышей (не показано), некоторые их потомки будутсодержать два модифицированных гена (по одному на каждой хромосоме) во всех своих клетках.Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 991Рис. 8.66. Трансгенные мыши, экспрессирующие мутантную ДНК-хеликазу, преждевременно стареют.Хеликаза, кодируемая геном Xpd, участвует в транскрипции и репарации ДНК.
По сравнению с мышьюдикого типа того же возраста (а) у трансгенной мыши (б), экспрессирующей дефектную версию Xpd, проявляется множество признаков преждевременного старения, включая остеопороз, истощение, седину,бесплодие и меньшую продолжительность жизни. Использованная здесь мутация в Xpd нарушает активность хеликазы и имитирует мутацию, которая у людей вызывает трихотиодистрофию, заболевание,характеризующееся ломкими волосами, нарушениями развития скелета и очень маленькой продолжительностью жизни. Эти результаты указывают на то, что накопление повреждений ДНК может вноситьвклад в процессы старения как у мышей, так и у людей.
(Из J. de Boer et al., Science 296: 1276–1279, 2002.С любезного разрешения издательства AAAS.)пролиферируют и затем снова дифференцируются в другой тип клеток. При некоторых условиях дедифференцированные клетки могут даже сформироватьапикальную меристему, которая затем даст начало абсолютно новому растению,включая гаметы. Такая удивительная гибкость развития растительных клеток может быть использована для создания трансгенных растений из клеток, растущихв культуре.Когда образец ткани растения культивируют в стерильной среде, содержащей питательные вещества и соответствующие регуляторы роста, многие клеткипролиферируют бесконечно и беспорядочно, формируя массу относительно недифференцированных клеток, называющуюся каллюсом. Аккуратная манипуляция питательными веществами и регуляторами роста позволяет стимулироватьформирование в каллюсе апикальных меристем сначала побегов, а потом корней.Для многих видов таким образом можно воссоздать целое новое растение.Каллюсные культуры можно механически диссоциировать на отдельные клетки,которые будут расти и делиться в суспензионной культуре.
В случае некоторыхрастений, включая табак, петунию, морковь, картофель и Arabidopsis, единственнуюклетку, выделенную из суспензионной культуры, можно вырастить в маленькийсгусток (клон), из которого можно воссоздать целое растение. Клетка, из которойможет быть выращена любая часть организма, называется тотипотентной. Также, как можно получить мутантную мышь путем генетических манипуляций ЭСклетками в культуре, создают трансгенное растение из единственной тотипотентнойрастительной клетки, претерпевшей трансфекцию ДНК в культуре (рис. 8.67).Методы получения трансгенных растений значительно ускорили прогрессво многих областях клеточной биологии растений.
Например, они сыграли важнуюроль в выделении рецепторов регуляторов роста и анализе механизмов морфогенеза и экспрессии генов у растений. Также они открыли множество возможностейв сельском хозяйстве, приносящих пользу как потребителям, так и производителям.Например, стало возможным модифицировать липиды, крахмал и белки, запасаемые992Часть III. МетодыРис. 8.67.
Процесс получения трансгенного растения. (а) Краткий обзор процесса. Из листа вырезаюткруглый участок и инкубируют его в культуре вместе с клетками Agrobacterium, несущими рекомбинантную плазмиду с селективным геном-маркером и нужным трансгеном. Поврежденные клетки на краюдиска выделяют вещества, привлекающие клетки Agrobacterium. Затем бактерии вводят ДНК в эти клетки. Только те клетки растения, которые приняли соответствующую ДНК и экспрессируют селективныймаркерный ген, выживут и будут пролифелировать и образовывать каллюс. Манипуляция регуляторамироста и питательными веществами заставляет каллюс формировать побеги, которые затем пускают корнии вырастают во взрослые растения, несущие трансген. (б) Приготовление рекомбинантной плазмидыи ее перенос в растительную клетку.
Плазмиду Agrobacterium, в норме несущую последовательностьТ-ДНК, модифицируют, вставляя селективный маркерный ген (например, ген устойчивости к канамицину) и нужный трансген между состоящими из 25 п. н. повторами Т-ДНК. Когда Agrobacterium узнаетклетку растения, она эффективно передает цепь ДНК, несущую эти последовательности, в растительнуюклетку при помощи специальных механизмов, которые в норме переносят последовательность Т-ДНКплазмиды.Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 993в семенах, для увеличения устойчивости к паразитам и вирусам, а также создаватьрастения, способные выживать в экстремальных условиях, например в солончаковых болотах или на сухой почве.Многие важные прорывы в понимании развития животных сделаны в ходеизучения фруктовой мушки Drosophila и круглого червя C.
elegans, которые легкоподдаются классическому генетическому анализу и экспериментальным манипуляциям. Прогресс в биологии развития растений был в прошлом сравнительно медленным. Многие удобные для генетического анализа растения, такие как кукурузаи томат, обладают длинными жизненными циклами и очень крупными геномами,поэтому классический анализ и молекулярный генетический анализ требовали многовремени. В последние годы все больше внимания уделяется более быстрорастущемумаленькому сорняку резуховидке Таля (Arabidopsis thaliana), обладающему несколькими значительными достоинствами в качестве «модельного растения» (см.рис. 1.46 и 22.112).
Относительно небольшой геном Arabidopsis стал первым полностью расшифрованным растительным геномом. Темпы исследования этого организмав настоящее время догоняют темпы исследования модельных животных.8.5.15. Крупные собрания меченых нокаутов позволяют изучатьфункции каждого гена организмаДля создания исчерпывающих библиотек мутаций в различных модельныхорганизмах, включая S. cerevisiae, C. elegans, Drosophila, Arabidopsis и мышей,необходимы совместные усилия многих лабораторий. В каждом случае конечнаяцель — получение набора мутантных линий, в которых каждый ген организмасистематически удаляется или изменяется так, чтобы он мог быть условно нарушенным.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
