Часть 3 (1129751), страница 30
Текст из файла (страница 30)
et al. (1978) The isolation of structural genes from libraries ofeukaryotic DNA. Cell 15: 687–701.Mullis K. B. (1990). The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci.Am. 262: 56–61.Nathans D. & Smith H. O. (1975) Restriction endonucleases in the analysis andrestructuring of dna molecules. Annu. Rev. Biochem. 44: 273–293.Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel S.
et al. (1988) Primer-directed enzymaticamplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487–491.Sambrook J., Russell D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rded. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.Глава 8. Манипуляция белками, ДНК и РНК 1009Sanger F., Nicklen S. & Coulson A. R. (1977) DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74: 5463–5467.Smith M. (1994) Nobel lecture. Synthetic DNA and biology. Biosci. Rep. 14:51–66.Southern E. M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragmentsseparated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503–517.The Arabidopsis Genome Initiative (2000) Analysis of the genome sequence ofthe flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408: 796–815.The С.
elegans Sequencing Consortium (1998) Genome sequence of the nematodeC. elegans: a platform for investigating biology. Science 282: 2012–2018.Venter J. C., Adams M. A., Myers E. W. et al. (2000) The sequence of the humangenome. Science 291: 1304–1351.Изучение экспрессии и функционирования геновBoone C., Bussey H. & Andrews B. J. (2007) Exploring genetic interactions andnetworks with yeast. Nature Rev.
Genet. 8: 437–449.Botstein D., White R. L., Skolnick M. & Davis R. W. (1980) Construction ofa genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am.J. Hum. Genet. 32: 314–331.DeRisi J. L., Iyer V. R. & Brown P. O. (1997) Exploring the metabolic and geneticcontrol of gene expression on a genomic scale. Science 278: 680–686.International HapMap Consortium (2005) A haplotype map of the human genome.Nature 437: 1299–1320.Lockhart D. J. & Winzeler E. A. (2000) Genomics, gene expression and DNAarrays. Nature 405: 827–836.Mello C. C.
& Conte D. (2004) Revealing the world of RNA interference. Nature431: 338–342.Nusslein-Volhard С. & Weischaus E. (1980) Mutations affecting segment numberand polarity in Drosophila. Nature 287: 795–801.Palmiter R. D & Brinster R. L. (1985) Transgenic mice. Cell 41: 343–345.Rubin G. M. & Sprading A. C. (1982) Genetic transformation of Drosophila withtransposable element vectors. Science 218: 348–353.Sabeti P. C., Schaffner S. F., Fry В.
et al. (2006) Positive natural selection inthe human lineage. Science 312: 1614–1620.Weigel D. & Glazebrook J. (2001) Arabidopsis: A Laboratory Manual. ColdSpring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.9Визуализация клетокПоскольку клетки маленькие и сложные, увидеть их структуру и определитьмолекулярный состав сложно, но еще труднее узнать, как функционируют ихкомпоненты. Имеющиеся в нашем распоряжении инструменты определяют, чтомы можем узнать о клетках.
Часто появление новых методов приводит к прорывам в клеточной биологии. Таким образом, для того чтобы понять современнуюклеточную биологию, необходимо знать кое-что об этих методах.В этой главе мы кратко опишем некоторые важнейшие методы микроскопии,используемые для изучения клеток. Понимание структурной организации клеток — первая предпосылка для изучения функционирования клеток. Мы начнемс оптической микроскопии, потому что клеточная биология началась со световогомикроскопа, и он до сих пор служит незаменимым инструментом. В последние годыоптическая микроскопия приобрела даже большее значение благодаря развитиюметодов специфического мечения и визуализации отдельных клеточных составляющих и реконструкции их трехмерной структуры.
Важное преимущество оптическоймикроскопии состоит в том, что свет, в общем, не нарушает и не изменяет структуру.Вводя в специфические клеточные компоненты флуоресцентные зонды, напримерфлуоресцентные белки, мы можем наблюдать их движение, динамику и взаимодействия в живой клетке. Разрешение оптической микроскопии ограничено длинойволны видимого света. В электронной микроскопии вместо света используют пучокэлектронов, что позволяет визуализировать макромолекулярные комплексы внутриклетки практически в атомном разрешении и в трех измерениях.Оптическая микроскопия и электронная микроскопия — важные методы,но по-настоящему интересными их делают те открытия в области структурнойорганизации клеток, которые они позволили ученым сделать.
Используйте этуглаву в качестве справочника и читайте ее вместе с последующими главами, а некак введение в них.9.1. Наблюдая клетки в световой микроскопДиаметр типичной животной клетки составляет 10–20 мкм, что примерноравно одной пятой самой маленькой частички, видимой невооруженным глазом.Только после того как в первой половине XIX века стали доступны хорошие световые микроскопы, Schleiden и Schwann предположили, что все ткани растенийи животных представляют собой агрегаты отдельных клеток.
Это открытие, произошедшее в 1838 г. и носящее название клеточной доктрины, отмечает формальноерождение клеточной биологии.Животные клетки не только очень малы, они еще бесцветны и прозрачны.Вследствие этого открытие их основных внутренних свойств зависело от разработкиво второй половине XIX века различных красителей, делавших клетки достаточноГлава 9. Визуализация клеток 1011контрастными для того, чтобы рассматривать их внутреннее строение. Точно также появившийся в начале 40-х гг. XX века значительно более мощный электронныймикроскоп потребовал развития новых методов фиксации и окрашивания клеток.Только после этого тонкости внутренней структуры клеток смогли стать достояниемученых.
До сих пор микроскопия зависит от методов приготовления препаратовточно так же, как и от рабочих характеристик микроскопа. Следовательно, мы будемв равной степени уделять внимание как обоим инструментам, так и приготовлениюпрепаратов. Начнем со светового микроскопа.Серия изображений на рис. 9.1 иллюстрирует воображаемый переход от большого пальца до атомов. Каждое последующее изображение представляет собой увеличенное в десять раз предыдущее.
Невооруженным глазом можно увидеть толькоРис. 9.1. Соотношение масштабов живых клеток и атомов. На каждой картинке показано изображение,увеличенное в десять раз по сравнению с предыдущим, в воображаемом ряду от большого пальца, черезклетку кожи, до рибосомы и набора атомов, составляющего одну из множества белковых молекул нашего организма.
Атомное строение макромолекул, как показано на двух последних картинках, обычнолежит за пределами мощности электронного микроскопа.1012Часть III. Методыто, что изображено на первых двух картинках, разрешение светового микроскопараспространяется до четвертой, электронного — примерно до седьмой–восьмой.На рис. 9.2 показаны размеры различных клеточных и субклеточных структури пределы визуализации различных микроскопов.9.1.1. Световой микроскоп разрешает детали изображения на расстоянии 0,2 мкм друг от другаФундаментальное ограничение всех микроскопов состоит в том, что данныйтип излучения не может быть использован для исследования деталей структуры,меньших, чем его длина волны. Таким образом, ограничение разрешения световогомикроскопа задается длиной волны видимого света, которая находится в пределахот 0,4 мкм (фиолетовый) до 0,7 мкм (темно-красный).
На практике это означает, что бактерии и митохондрии, ширина которых составляет примерно 500 нм(0,5 мкм), являются самыми маленькими объектами, форму которых можно ясноразглядеть в световой микроскоп. Меньшие объекты будут зашумлены за счетэффектов, связанных с волновой природой света. Чтобы понять, почему так происходит, мы должны проследить путь лучасвета по мере его прохождения через линзымикроскопа (рис.
9.3). Свет имеет волновую природу, поэтому он не следует идеализированной прямойтраектории, предсказываемой геометрическойоптикой. Вместо этого, световые волны идутпо оптической системе по нескольким немногоотличным друг от друга путям. В результатесветовые волны интерферируют друг с другом, что приводит к возникновению явленияоптической дифракции. Если два волновыхпакета, достигших одной и той же точки разными путями, находятся точно в фазе (пиксовпадает с пиком, минимум — с минимумом),они усилят друг друга и яркость увеличится.Наоборот, если волновые пакеты находятсяв противофазе, они будут интерферироватьтаким образом, что полностью или частичнодруг друга нейтрализуют (рис.
9.4). Взаимодействие света с объектом изменяет соотношение фаз световых волн, что приводит квозникновению сложных интерференционныхРис. 9.2. Разрешающая способность. Размеры клетоки их компонентов приведены на логарифмической шкале, объекты, легко разрешимые невооруженным глазом,световым и электронным микроскопами. В микроскопии часто используют следующие единицы длины:1 мкм (µм, микрометр) = 10–6 м1 нм (нанометр) = 10–9 м1 Å (ангстрем) = 10–10 м.Глава 9.
Визуализация клеток 1013Рис. 9.3. Световой микроскоп. (а) Схема прохождения света в микроскопе. Свет фокусируется на препарате линзами конденсора. Линзы объектива и окуляра настраивают таким образом, чтобы фокусироватьизображение освещенного препарата в глазе. (б) Современный исследовательский световой микроскоп.(б, с любезного разрешения Andrew Davies.)картин. Например, при большом увеличении тень границы, равномерно освещеннойсветом одной длины волны, выглядит как набор параллельных линий (рис.
9.5),а круглое пятно — как набор концентрических окружностей. По той же причинеединственная точка через микроскоп будет видеться как размытый диск, а дваблизкорасположенных точечных объекта могут давать перекрывающиеся изображения или сливаться в одно. Улучшение качества линз не способно преодолеть этоограничение, накладываемое волновой природой света.Минимальное расстояние, на котором два объекта различимы по отдельности – предел разрешения, – зависит как от длины волны света, так и от числовойапертуры используемой системы линз. Числовая апертура — это мера ширинывходного зрачка микроскопа, масштабированная относительно расстояния до объекта; чем шире микроскоп «раскрывает свой глаз», тем «острее» он «видит» (рис. 9.6).При наилучших условиях, с фиолетовым светом (длина волны = 0,4 мкм) и численной апертурой 1,4, световой микроскоп теоретически способен дать разрешение около 0,2 мкм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
