Часть 3 (1129751), страница 38
Текст из файла (страница 38)
В дополнение к возможности точного изменения положения AFM способна измерять механическуюсилу, налагаемую на зонд при его движении вдоль поверхности (рис. 9.37, а). AFMразработана для визуализации и измерения молекулярных свойств поверхности.В этом режиме зонд сканирует поверхность, двигаясь вверх и вниз так, чтобы силаего взаимодействия с образцом оставалась постоянной.
Таким образом, AFM позволяет обнаружить любые объекты, например, белки, расположенные на плоскойповерхности (см. рис. 10.14 и 10.32). Однако AFM не ограничивается простой визуализацией поверхности и также может служить для захвата и переноса отдельныхмолекул. Фактически, это описанный выше оптический пинцет в молекулярноммасштабе.
При помощи данного метода можно измерить механические свойстваотдельных белковых молекул. Например, AFM используют для разворачиванияизолированных белковых молекул и измерения энергетики фолдинга (рис. 9.37, б).Потенциал механического зондирования белков и их организации в заданныеструктуры сейчас только начинает раскрываться, но кажется маловероятным, чтоданный метод в будущем приобретет большое значение.9.1.16. Молекулы можно метить радиоизотопамиКак мы видели, в клеточной биологии часто бывает важно определить количества определенных молекул, знать, где они располагаются в клетке и как их уровеньи локализация меняются в ответ на внеклеточные сигналы. Среди таких молекулмогут быть как маленькие неорганические ионы, например Ca2+ и H+, так и крупныемакромолекулы, например определенные белки, РНК или последовательности ДНК.Мы обсудили, как для анализа таких молекул можно применять чувствительныефлуоресцентные методы, а также следить за их динамическим поведением внутриклетки.
В заключение данного раздела мы опишем, как для слежения за определенными молекулами внутри клетки используют радиоизотопы.Большинство встречающихся в природе простых веществ представляет собойсмесь слегка различающихся изотопов. Они отличаются друг от друга массой ядраатома, но поскольку они обладают одинаковым количеством протонов и электронов,одинаковы и их химические свойства. В радиоактивных изотопах, или радиоизотопах, ядро нестабильно и претерпевает случайный распад с образованием другогоядра.
В процессе распада испускаются либо высокоэнергетические субатомныечастицы, например электроны, либо излучение, к примеру гамма-лучи. Используяхимический синтез для включения одного или нескольких радиоактивных изотоповв малую молекулу, например сахар или аминокислоту, можно проследить судьбуэтой молекулы (и ее отдельных атомов) в течение любой биологической реакции.Несмотря на то что в природе радиоизотопы встречаются редко (из-за их нестабильности), их можно получать в больших количествах в ядерных реакторах,в которых стабильные атомы бомбардируются высокоэнергетическими частицами.В результате доступны радиоизотопы многих важных с биологической точки зренияэлементов (таблица 9.1).
Испускаемое ими излучение можно измерять различнымиспособами. Электроны (β-частицы) можно регистрировать в счетчике Гейгера благодаря создаваемой ими ионизации газа, или в сцинтилляционном счетчике, наблюдаяРис. 9.37. Отдельными белковыми молекулами можно манипулировать при помощи атомно-силовой микроскопии. (а) Схематическое изображениеключевых компонентов атомно-силового микроскопа (AFM). На рисунке показан чувствительный к силе зонд, прикрепленный к отдельной белковоймолекуле, как в эксперименте, описанном на (б). (б) Титин – это огромная белковая молекула, за счет которой мышцы обладают пассивной эластичностью (см. рис.
16.76). Растяжимость этой молекулы можно проанализировать напрямую при помощи короткого искусственно синтезированного белка,содержащего восемь повторяющихся Ig-доменов одной из областей титина. В данном эксперименте зонд AFM используют для захвата и постепенногорастягивания отдельной молекулы до тех пор, пока она не порвется. При приложении силы каждый Ig-домен внезапно начинает разворачиваться,и можно зарегистрировать необходимую в каждом случае силу (около 200 пН). Область кривой «сила-растяжение», показанная зеленым, описывает последовательное разворачивание каждого из восьми белковых доменов.
(Адаптировано из W. A. Linke et al., J. Struct. Biol. 137: 194–205, 2002. С любезногоразрешения Elsevier.)1044Часть III. МетодыГлава 9. Визуализация клеток 1045маленькие вспышки света, которые они Таблица 9.1. Некоторые широко применяемые в биологии радиоизотопыиндуцируют в сцинтилляционной жидкоИзотопПериод полураспадасти. Эти методы позволяют точно измерять32P14 днейсодержание определенного радиоизотопа131I8,1 днейв биологическом образце. При помощи35S87 днейсветовой или электронной микроскопии14C5 570 леттакже можно определить местоположение45Ca164 днярадиоизотопа в образце радиоавтографией,3H12,3леткак мы опишем ниже. Все эти методы детекции очень чувствительны: в благоприятныхусловиях можно зарегистрировать почти каждый распад и, следовательно, каждыйраспадающийся радиоактивный атом.Изотопы расположены в порядке уменьшения энергии испускаемого β-излучения(электронов).
131I также испускает γ-радиацию. Период полураспада — это время,необходимое для распада 50 % атомов изотопа.9.1.17. Радиоизотопы используются для слежения за молекуламивнутри клеток и организмовОдним из первых случаев применения радиоизотопов в биологии было отслеживание химических превращений углерода в процессе фотосинтеза. Одноклеточные зеленые водоросли выращивали в атмосфере, содержащей радиоактивномеченый CO2 (14CO2). В разные моменты времени после освещения их растворимоесодержимое разделяли бумажной хроматографией.
Малые молекулы, содержащиеполученные из CO2 атомы 14C, регистрировали при помощи листа фотографической пленки, который клали поверх высохшей бумажной хроматограммы. Такойподход позволил идентифицировать большинство ключевых компонентов процессафотосинтеза от CO2 до сахара.Радиоактивные молекулы можно использовать для наблюдения за ходом практически любого процесса в клетках. В типичном эксперименте клетки снабжаютрадиоактивной молекулой-предшественником. Радиоактивные молекулы смешиваютс исходно присутствовавшими в клетке немечеными соединениями; и те, и другиевоспринимаются клеткой одинаково, поскольку они различаются только массой ядраатома.
Изменения локализации или химической формы радиоактивных молекулможно отслеживать во времени. Разрешение таких экспериментов часто улучшаетсяпри использования протокола мечения с вытеснением метки (pulse-chase), в которомрадиоактивное вещество (стадия pulse) добавляют только на короткий промежутоквремени, затем его отмывают и заменяют на нерадиоактивные молекулы (стадияchase). Через равные промежутки времени собирают образцы, в каждом из которыхопределяют химическую форму или локализацию радиоактивной метки (рис. 9.38).Эксперименты с вытеснением метки в сочетании с радиоавтографией сыграли важную роль, например, в определении того, как секреторные белки попадают из ЭРво внеклеточное пространство.Радиоизотопное мечение является уникальным способом отличить химическиидентичные, но обладающие разной историей молекулы, например молекулы, синтезирующиеся в разное время.
При помощи этого метода показано, что почти всемолекулы в живой клетке непрерывно деградируют и заменяются новыми, дажеесли клетка не растет и, на первый взгляд, находится в стационарном состоянии.1046Часть III. МетодыТакой «круговорот», который иногда происходит очень медленно, было бы практически невозможно обнаружить без радиоизотопов.Сегодня почти все распространенные малые молекулы доступны в радиоактивной форме из коммерческих источников, и практически любую биологическуюмолекулу, какой бы сложной она ни была, можно радиоактивно пометить.
Можносинтезировать соединения с радиоактивными атомами в определенных положениях,что позволяет независимо прослеживать судьбы различных частей одной и той жемолекулы в процессе биологических реакций (рис. 9.39).Как отмечено выше, одно из важных применений радиоактивности в клеточнойбиологии — локализация радиоактивного соединения в срезах клеток или тканейпри помощи радиоавтографии. В данном методе живые клетки на короткий промежуток времени подвергают действию определенного радиоактивного соединенияи инкубируют некоторое время, давая метке проникнуть в клетки. Затем их фиксируют и подготавливают для световой или электронной микроскопии.
На каждыйпрепарат накладывают тонкую пленку фотографической эмульсии и оставляют образцы на несколько дней в темноте. Это позволяет радиоизотопу распасться. Затемэмульсию проявляют и положение радиоактивности в каждой клетке определяют поположению проявленных серебряных зерен (см. рис. 5.29). Например, если клеткиобработать 3H-тимидином, радиоактивным предшественником ДНК, можно показать,что ДНК синтезируется и хранится в ядре (рис. 9.40). И наоборот, если обработатьклетки 3H-уридином, радиоактивным предшественником РНК, окажется, что РНКсначала появляется в ядре, а затем быстро мигрирует в цитоплазму.
Радиоактивныеметки также можно регистрировать радиоавтографией после их очистки от другихмолекул гель-электрофорезом: таким способом часто определяют положение в гелекак белков (см. рис. 8.23), так и нуклеиновых кислот (см. рис. 8.33, а).ЗаключениеДоступно множество методов оптической микроскопии, направленных на наблюдение клеток.
Фиксированные и окрашенные клетки можно наблюдать в обычный световой микроскоп, тогда как связанные с флуоресцентными красителямиантитела можно использовать для локализации определенных молекул в клеткепри помощи флуоресцентного микроскопа. Живые клетки можно наблюдатьв фазово-контрастном, дифференциальном интерференционном контрастном,Рис. 9.38. Логика типичного эксперимента с вытеснением метки с использованием радиоизотопов.Камеры, помеченные A, B, C и D, могут представлять собой либо различные компартменты клетки (регистрируемые радиоавтографией или экспериментами по фракционированию клеток) или различныехимические соединения (регистрируемые хроматографией или другими химическими методами).Глава 9.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
