Часть 3 (1129751), страница 41
Текст из файла (страница 41)
МетодыРис. 9.50. Сканирующая электронная микроскопия. (а) Полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа микрофотография стереоцилии, выступающей из волосковой клетки внутреннегоуха лягушки-быка. (б) Дифференциальная интерференционная контрастная световая микроскопияи (в) трансмиссионная электронная микроскопия тонкого среза. (С любезного разрешения Richard Jacobsи James Hudspeth.)с эффективным увеличением до 20 тысяч раз). В результате метод обычно используют для изучения целых клеток и тканей, а не субклеточных органелл. Однакоразработаны микроскопы очень высокого разрешения, в которых в качестве источника электронов выступает когерентная автоэлектронная эмиссионная пушка.Они могут соперничать с трансмиссионными в разрешении (рис.
9.51).9.2.5. Металлическое напыление позволяет исследовать свойстваповерхностей при помощи трансмиссионной электронной микроскопии высокого разрешенияTEM также можно использовать для исследования поверхности образцаи обычно с лучшим разрешением, чем SEM, например, для определения структурыотдельных макромолекул. Как и в сканирующей электронной микроскопии, на высушенный образец наносят тонкую пленку тяжелого металла, например платины.Однако в данном случае металл распыляют под углом, чтобы покрывающий слойбыл в одних местах толще, чем в других. Данный метод, называемый напылениемметалла, создает эффект оттенения (отсюда английский термин metal shadowing),благодаря чему изображение выглядит трехмерным.Глава 9. Визуализация клеток 1057Рис. 9.51.
Ядерная пора. Быстрозамороженные ядерные оболочки визуализированы при помощи SEMвысокого разрешения, снабженного в качестве источника электронов автоэлектронной эмиссионнойпушкой. Данные изображения обеих сторон поры показывают предел разрешения микроскопа, и ихнужно сравнивать с рис. 12.9. (С любезного разрешения Martin Goldberg и Terry Allen.)Некоторые обработанные таким образом препараты достаточно тонки илималы для того, чтобы электроны напрямую в них проникали.
Это справедливодля отдельных молекул, макромолекулярных комплексов и вирусов, которые до напыления металламожно высушить на плоской поддерживающейпленке, изготовленной из относительно прозрачного для электронов материала, например, углерода или пластика. Также при помощи напыления металла можно визуализировать внутреннююструктуру клеток. В этом случае образцы быстрозамораживают (как описано выше) и расщепляютлезвием ножа. Содержание льда в разрушенной поверхности уменьшают путем испарения льда в вакуум при повышении температуры — этот процессносит название лиофилизации (замораживаниявысушивания). На части клетки, экспонированныев этом процессе травления, напыляют металлдля создания металлической копии.
Оставшийся органический материал клетки должен бытьрастворен, для того чтобы осталась лишь тонкаяметаллическая реплика поверхности образца. Затем ее укрепляют углеродной пленкой, помещаютна сетку и исследуют в трансмиссионном электронном микроскопе (рис. 9.52). Данный метод позволяет визуализировать структуру внутреннегосодержания клетки и ее трехмерную организациюс удивительной четкостью (рис.
9.53).Рис. 9.52. Приготовление металлической реплики поверхности образца. Обратите внимание, что толщина металла отражает контур поверхности исходного образца.1058Часть III. МетодыРис. 9.53. Регулярное расположение белковых филаментов в мышце насекомого. Для получения данного изображения мышечные клетки быстро заморозили до температуры жидкого гелия, расщепилипо цитоплазме и подвергли глубокому травлению. Затем была изготовлена и исследована при большомувеличении металлическая реплика. (С любезного разрешения Roger Cooke и John Heuser.)9.2.6. Негативное окрашивание и криоэлектронная микроскопияпозволяют видеть макромолекулы с высоким разрешениемНесмотря на то что изолированные макромолекулы, например ДНК и крупные белки, можно визуализировать в электронном микроскопе путем напылениятяжелого металла для создания контрастности, более тонкую структуру можно увидеть, используя негативное окрашивание.
По этому методу молекулы, нанесенныена тонкую углеродную пленку, смешивают с раствором соли тяжелого металла,например уранилацетата. После того как образец высыхает, очень тонкий слой солиметалла покрывает углеродную пленку, за исключением областей, где расположенаадсорбированная макромолекула. Поскольку электроны проходят через макромолекулы значительно лучше, чем через окружающую соль тяжелого металла, создаетсяобратное негативное изображение молекулы. Негативное окрашивание особенноэффективно для визуализации макромолекулярных агрегатов, например вирусови рибосом, и субъединичной структуры белковых филаментов (рис.
9.54).Напыление металла и негативное окрашивание позволяют получить изображения маленьких макромолекулярных ансамблей в высоком разрешении, но пределразрешения обоих методов ограничивает размер самой маленькой металлическойчастицы в окрашивании или напылении. Недавно разработанные альтернативныеподходы позволяют напрямую визуализировать в высоком разрешении даже внутреннее содержимое таких трехмерных структур, как вирусы и органеллы.
В данномметоде, носящем название криоэлектронной микроскопии, ключевым моментомопять является быстрое замораживание для создания стекловидного льда. На микроскопической сетке приготавливают очень тонкую (около 100 нм) пленку воднойсуспензии вируса или очищенного макромолекулярного комплекса. Затем образецбыстро охлаждают путем помещения его в хладоагент. Для поддерживания такоговодного препарата при температуре –160° C в вакууме микроскопа используют специальный держатель, в котором образец можно наблюдать напрямую без фиксации,окрашивания или высушивания. В отличие от негативного окрашивания, в котороммы видим окрашивание вокруг исключенного образца, водная криоэлектроннаяГлава 9. Визуализация клеток 1059микроскопия создает изображение макромолекулярной структуры самой по себе.Однако для извлечения максимально возможного объема информации о структуренеобходимо использование специальных методов обработки изображения, которыемы опишем ниже.9.2.7. Для увеличения разрешения можно объединять несколькоизображенийЛюбое изображение, полученное электронным или световым микроскопом,составлено из частиц — электронов или фотонов, — попадающих в некоторый детектор.
Но эти частицы подчиняются законам квантовой механики, поэтому числодостигших детектора частиц можно предсказать только статистически. При предельно большом числе частиц распределение в детекторе достаточно точно определяетсявизуализируемым образцом. Однако при меньшем количестве частиц исходнаяструктура на изображении зашумляется флуктуациями числа регистрируемых частиц на каждом участке образца. Термин «шум» описывает случайные отклонения,ухудшающие реальное изображение образца. Шум играет большую роль в световоймикроскопии при маленькой интенсивности освещения, но в электронной микроскопии он создает серьезные сложности при работе с неокрашенными макромолекулами. Молекула белка, не повреждаясь, выдерживает только несколько десятковэлектронов на квадратный нанометр, и эта доза на несколько порядков ниже, чемнеобходимо для получения изображения в атомном разрешении.Решение состоит в получении изображений множества одинаковых молекул —до десятков тысяч отдельных микрофотографий — и объединении их для созданияусредненного изображения, на котором будут видны детали структуры, скрытыешумом на исходных изображениях.
Этот метод называется одночастичной реконструкцией изображений. Однако до объединения отдельных изображений их необходимо совместить друг с другом. Иногда можно заставить белки и комплексыобразовать кристаллическую структуру, в которой каждая молекула расположенаРис. 9.54. Негативно окрашенные актиновые филаменты. На данной микрофотографии, полученнойпри помощи трансмиссионной электронной микроскопии, каждый филамент имеет толщину около 8 нми при ближайшем рассмотрении состоит из спиральной цепи глобулярных молекул актина. (С любезногоразрешения Roger Craig.)1060Часть III.
Методыв определенной ориентации в узлах регулярной решетки. В данном случае проблемасовмещения легко решается, и такой тип электронной кристаллографии позволил расшифровать несколько структур белков в атомном разрешении. Однако, в принципе,нет строгой необходимости в кристаллических решетках. При помощи компьютераможно обработать и объединить цифровые изображения случайно распределенныхи по-разному ориентированных молекул для получения реконструкций высокогоразрешения. Несмотря на то что структуры, обладающие некоторой внутреннейсимметрией, упрощают процесс совмещения и делают его более точным, этот методприменяют и для структур, лишенных симметрии, например рибосом.
На рис. 9.55показана структура икосаэдрического вируса, расшифрованная с высоким разрешением при помощи сочетания множества частиц и совмещения изображений.В случае регулярных кристаллических решеток электронная микроскопия достигает разрешения 0,3 нм. Этого достаточно для того, чтобы наблюдать внутреннееРис. 9.55. Одночастичная реконструкция изображения. Сферические белковые оболочкивируса гепатита Б сохраняются в тонкой пленкельда (а) и визуализируются в трансмиссионномэлектронном микроскопе.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
