Часть 3 (1129751), страница 42
Текст из файла (страница 42)
Тысячи отдельных частиц объединены при помощи одночастичнойреконструкции для получения трехмерной картыикосаэдрической частицы, показанной на (б).Отдельный белковый димер (в), формирующийвыступы на поверхности вируса, в двух ориентациях показывает, что разрешения (0,74 нм)достаточно для расшифровки упаковки полипептидной цепи. (С любезного разрешения B. Böttcher, S. A. Wynne и R. A. Crowther (а); B. Böttcher,S. A. Wynne и R. A. Crowther, Nature 386: 88–91,1997 (б и в) и издательства Macmillan Publishers Ltd.)Глава 9.
Визуализация клеток 1061атомное строение белков. Более того, разрешение в данном случае может соперничатьс рентгеноструктурным анализом. Предел разрешения одночастичной реконструкции изображений сейчас составляет около 0,5 нм, достаточно для идентификациисубъединиц и доменов белков и, частично, вторичной структуры белка. Несмотряна то что электронная микроскопия вряд ли заменит рентгеноструктурный анализ(см.
главу 8) в качестве метода определения структуры макромолекул, она обладает несколькими очевидными преимуществами. Во-первых, ей далеко не всегдатребуются кристаллические образцы. Во-вторых, она способна визуализироватьочень большие комплексы — структуры, которые могут быть слишком крупнымиили изменчивыми для получения удовлетворительных кристаллов.Анализ крупных и сложных макромолекулярных структур упрощается, еслиизвестна, например, из рентгеноструктурного анализа, атомная структура однойили нескольких субъединиц комплекса.
Молекулярные модели тогда могут бытьматематически «вписаны» в оболочку структуры, определенной в меньшем разрешении при помощи электронного микроскопа. На рис. 9.56 показана структурарибосомы и определенное данным методом положение связанного с ней фактораосвобождения (см. также рис.
6.74 и 6.75).9.2.8. Различные ракурсы одного объекта можно объединитьдля получения трехмерной реконструкцииДетекторы, применяемые для записи изображений электронных микроскопов,дают двумерные изображения. Благодаря большой глубине поля микроскопа всечасти трехмерного образца находятся в фокусе, и конечное изображение пред-Рис. 9.56.
Одночастичая реконструкция изображения и подбор молекулярной модели. Бактериальныерибосомы, содержащие освобождающий фактор, необходимый для высвобождения белка из рибосомы,и без него, использованы для получения трехмерных крио-ЭМ карт с разрешением, превышающим 1 нм.Почти 20 тысяч изображений отдельных рибосом, сохраненных во льду, использовали для полученияодночастичной реконструкции.
На (а) 30S-субъединицу (желтая) и 50S-субъединицу рибосомы (синяя)можно отличить от дополнительной электронной плотности, соответствующей фактору терминацииRF2 (розовый). Затем известную молекулярную структуру RF2 вписали методами молекулярного моделирования в эту электронную плотность. (Из U. B. S. Rawat et al., Nature 421: 87–90, 2003. С любезногоразрешения Macmillan Publishers Ltd.)1062Часть III. МетодыРис. 9.57. Электронная (клеточная) томография. Быстрозамороженные, криозамещенные и заключенныев пластик образцы сохраняют в виде, очень близком к исходному живому состоянию.
Этот экспериментпоказывает данные анализа трехмерной структуры приготовленного таким образом аппарата Гольджиклетки почки крысы. Несколько толстых срезов (250 нм) клетки поворачивали по двум осям в электронном микроскопе высокого напряжения и записывали около 160 различных ракурсов. При помощиметодов электронной томографии цифровые данные объединили для получения конечной трехмернойреконструкции с разрешением около 7 нм. Затем на компьютере можно сделать очень тонкие срезывсего набора трехмерных данных, или томограммы, и получить тонкие срезы толщиной всего 4 нм,показанные здесь на (а) и (б).
Картина очень мало изменяется при переходе от одного среза к другому,но используя полный набор данных и вручную кодируя цвета мембран (б), можно получить полноетрехмерное изображение аппарата Гольджи и связанных с ним везикул (в). (Из M. S. Ladinsky et al., J. CellBiol. 144: 1135–1149, 1999. С любезного разрешения The Rockefeller University Press.)ставляет собой проекцию структуры вдоль направления наблюдения. Потеряннуюинформацию в третьем измерении можно восстановить, если у нас есть изображенияэтого же образца в различных ракурсах. Вычислительные алгоритмы для данногометода разработаны в 60-х гг., и их широко используют в медицинской компьютерной томографии (КТ).
В КТ устройство получения изображений движется вокруг пациента для получения различных ракурсов. В электронной (клеточной)томографии держатель образца в микроскопе наклоняется, что позволяет достичьтакого же результата. Таким образом, мы можем получить трехмерную реконструк-Глава 9. Визуализация клеток 1063цию в выбранной стандартной ориентации путем объединения набора различныхракурсов одного объекта в поле зрения микроскопа. Каждое отдельное изображениебудет сильно зашумлено, но их совмещение и усреднение в трех пространственных измерениях значительно снижает уровень шума, давая четкое изображениемолекулярной структуры. Начиная с толстых срезов заключенного в пластмассуматериала, трехмерные реконструкции, или томограммы, широко используютдля подробного описания анатомии маленьких областей клетки, например аппаратаГольджи (рис.
9.57) или цитоскелета. Однако все чаще исследователи применяютклеточную томографию к неокрашенным замороженным водным срезам и еще болеебыстро замороженным целым клеткам или органеллам (рис. 9.58). В настоящеевремя электронная микроскопия — мост между масштабами отдельной молекулыи целой клетки.Рис. 9.58. Использование крио-электронной микроскопии в сочетании с одночастичной реконструкцией. Помимо срезов, метод электронной томографии можно применять к маленьким нефиксированнымбыстрозамороженным образцам, которые исследовали в микроскопе при помощи поворачивающегосядержателя. В данном эксперименте аккуратно выделили маленькое ядро Dictyostelium и быстро заморозили его перед записью набора повернутых относительного друг друга изображений.
Эти дифференциальные цифровые изображения объединяют методами клеточной томографии для получения трехмерной томограммы. Показаны два тонких цифровых среза (10 нм), проходящих через эту томограмму,на которых можно увидеть вид отдельных ядерных пор сверху (а) и сбоку (б).
В трехмерной модели(в) видна поверхность пор (синяя), погруженная в ядерную оболочку (желтая). Из серии томограммудалось получить данные о более 300 отдельных ядерных пор, чьи структуры затем усреднили припомощи методов одночастичной реконструкции. Вид поверхности одной из таких пор на поверхностиядра показан на (г), а срез — на (д); их нужно сравнивать с рис. 12.10.
Поровый комплекс окрашен синим, а ядерная корзинка — коричневым. (Из M. Beck et al., Science 306: 1387–1390, 2004. С любезногоразрешения издательства AAAS.)1064Часть III. МетодыЗаключениеОпределение тонкой структуры мембран и органелл клетки требует высокого разрешения, достигаемого трансмиссионным электронным микроскопом.Определенные макромолекулы можно локализовать при помощи коллоидногозолота, связанного с антителами. Трехмерные изображения поверхностей клеток и тканей получают при помощи сканирующей электронной микроскопии.Также электронная микроскопия позволяет определить форму изолированныхмолекул, оттененных напылением металла или очерченных негативным окрашиванием.
Вычислительные методы используют для объединения множестваизображений или ракурсов под различными углами для получения подробных реконструкций макромолекул и молекулярных комплексов методами электроннойтомографии и одночастичной реконструкции. Эти методы часто применяютк замороженным образцам. Получаемое этими методами разрешение означает,что атомная структура отдельных макромолекул часто может быть «вписана»в изображения, полученные при помощи электронной микроскопии, и что TEMвсе чаще способна заполнить разрыв между структурами, расшифрованнымипри помощи рентгеноструктурного анализа и светового микроскопа.ЗадачиКакие из этих утверждений соответствуют действительности?Объясните почему9.1. Поскольку двойная спираль ДНК имеет ширину всего 10 нм, далекоза пределами разрешения светового микроскопа, в живых клетках невозможноувидеть хромосомы без специального окрашивания.9.2. Флуоресцентная молекула, поглотившая фотон света одной длины волны,всегда испускает фотон большей длины волны.9.3.
«Запертые» молекулы можно ввести в клетку и активировать интенсивнойвспышкой лазера в выбранный экспериментатором момент времени в определеннойточке клетки.Решите следующие задачи9.4. На схемах на рис. Q9.1 показаны траектории прохождения света черезобразец при использовании сухих линз и масляно-иммерсионных линз. Объясните,почему масляно-иммерсионные линзы должны давать лучшее разрешение.
Показа-Рис. Q9.1. Траектории света, проходящего через сухую и масло-иммерсионную линзы (задача 9.4). Белыйкружок в источнике световых лучей представляет собой образец.Глава 9. Визуализация клеток 1065тели преломления воздуха, стекла и масла равны1,00, 1,51 и 1,51 соответственно.9.5. На рис. Q9.2 изображена схема человеческого глаза. Показатели преломления структурна пути света равны: роговица — 1,38, внутриглазная жидкость – 1,33, хрусталик — 1,41 и стекловидное тело — 1,38.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
