Часть 3 (1129751), страница 40
Текст из файла (страница 40)
Во-первых, путем нанесения препарата на охлажденный жидким гелием полированный медный блок. Во-вторых, погружая образец в хладоагент илиопрыскивая его струей хладоагента, в качестве которого может служить, например,жидкий пропан. В-третьих, охлаждение можно проводить при высоком давлении.Некоторые замороженные образцы можно исследовать напрямую в электронном микроскопе, используя специальный охлажденный держатель для препаратов.В других случаях замороженный блок можно разбить для выявления внутреннихповерхностей или окружающий лед можно испарить для разоблачения внешнейповерхности. Однако зачастую мы хотим исследовать тонкие срезы и окрасить ихдля достижения адекватной контрастности изображения электронного микроскопа(смотри ниже).
Таким образом, в качестве компромисса ткань быстро замораживают,замещают воду, поддерживаемую в стекловидном состоянии, органическими растворителями и заключают ткань в пластмассу на основе смолы. Затем изготавливаютсрезы и проводят окрашивание. Несмотря на то что с технической точки зрения этотпроцесс все еще трудоемок и непрост, он позволяет стабилизировать и сохранитьткань в виде, очень близком к ее исходному живому состоянию (рис.
9.45).Контрастность электронного микроскопа зависит от атомного номера атомовобразца: чем выше атомный номер, тем больше рассеивается электронов и темвыше контрастность. Биологические ткани состоят из атомов с очень маленькимиатомными номерами (в основном, углерода, кислорода, азота и водорода). Для тогочтобы сделать их видимыми, их обычно пропитывают (до или после изготовлениясрезов) солями тяжелых металлов, например урана или свинца. Уровень пропитки,или «окрашивания», этими солями позволяет увидеть с разной степенью контрастности различные клеточные компоненты. Жиры после фиксации осмием, например,темноокрашены, что позволяет определить расположение клеточных мембран.9.2.3. Определенные макромолекулы можно локализовать при помощи иммунной электронной микроскопии коллоидного золотаМы видели, как для локализации определенных макромолекул антитела можноиспользовать в сочетании с флуоресцентной микроскопией.
Аналогичный метод —иммунная электронная микроскопия коллоидного золота — можно применить1052Часть III. МетодыРис. 9.45. Тонкий срез клетки. Данный тонкий срез принадлежит очень быстро замороженной дрожжевой клетке, в которой стекловидный лед был замещен сначала органическим растворителем, а затемпластмассой на основе смолы. Хорошо видны ядро, митохондрии, клеточная стенка, аппарат Гольджии рибосомы в состоянии, которое можно считать настолько приближенным к живой клетке, насколькоэто возможно. (С любезного разрешения Andrew Staehelin.)в электронном микроскопе.
Обычно тонкий срез инкубируют с определеннымпервичным антителом, а затем со вторичным антителом, к которому прикреплена частица коллоидного золота. Золотая частица является электронно-плотной,и в электронном микроскопе она выглядит как черная точка (рис. 9.46).Тонкие срезы в ТEМ часто не способны передать трехмерную организациюклеточных компонентов и могут направить исследователей по ложному пути. Линейная структура, например микротрубочка, может на срезе выглядеть точечнымобъектом, а срез через выступающие части единого сплошного тела неправильнойформы может заставить его выглядеть как два отдельных объекта. Третье измерениеможет быть восстановлено при помощи серии срезов (рис.
9.47), но это все равнопродолжительный и трудоемкий процесс.Однако даже тонкие срезы обладают значительной глубиной по сравнениюс разрешением электронного микроскопа, так что они могут вводить в заблуждениепо противоположной причине. Оптическая структура электронного микроскопа,а именно очень маленькая апертура, дает большую глубину поля, поэтому видимоеизображение соответствует суперпозиции (проекции) структур на разной глубине.Следующая сложность метода мечения коллоидным золотом состоит в том, чтоантитела и золотые частицы не проникают в смолу, применяемую для заключенияткани; следовательно, обнаружить можно только антигены на поверхности среза.
Этоозначает, что, во-первых, мала чувствительность обнаружения, так как молекулыантигена, расположенные в более глубоких частях среза, недоступны, и, во-вторых,можно получить ложное представление о том, какие структуры содержат антиген,а какие нет. Решение этой проблемы состоит в мечении образца до заключения егов смолу, когда клетки и ткани еще полностью доступны для меток.
Очень маленькиеГлава 9. Визуализация клеток 1053Рис. 9.46. Локализация белков в электронном микроскопе. Здесь иммунную электронную микроскопиюколлоидного золота используют для локализации четырех различных белковых компонентов полюсаверетена деления дрожжевой клетки. На верхней микрофотографии изображен тонкий срез дрожжевогомитотического веретена деления. Микротрубочки пересекают ядро и соединяются с полюсами веретенаделения, погруженными в ядерную оболочку.
Схема компонентов полюса веретена деления показананиже. Использованы антитела против четырех различных белков полюса веретена деления в сочетаниис частицами коллоидного золота (черные точки), указывающими на то, где в сложной структуре расположен каждый белок. (С любезного разрешения John Kilmartin.)частицы золота, диаметр которых составляет около 1 нм, лучше всего подходятдля данного метода.
Такие золотые частицы обычно невозможно напрямую увидетьна конечных срезах, поэтому вокруг них наращивают дополнительную серебрянуюили золотую оболочку. Этот процесс очень похож на проявление фотографий.9.2.4. Изображения поверхностей можно получить при помощисканирующей электронной микроскопииСканирующий (растровый) электронный микроскоп (SEM) позволяет напрямую получить изображение трехмерной структуры поверхности образца. SEMобычно более компактный, простой в управлении и дешевый прибор, чем трансмиссионный электронный микроскоп.
При этом в TEM для формирования изображения используют электроны, прошедшие через образец, в SEM электронырассеиваются образцом или испускаются из него. Исследуемый препарат фиксируют, высушивают и покрывают тонким слоем тяжелого металла. Альтернативноего можно быстро заморозить и перенести на предметный столик для прямого на-1054Часть III.
МетодыРис. 9.47. Трехмерная реконструкция при помощи серии срезов. (а) Трехмерная реконструкция митохондрии живой дрожжевой клетки, полученная путем объединения набора оптических срезов, позволяетувидеть сложную разветвленную структуру компартмента. Отдельные тонкие срезы такой структурыв электронном микроскопе могут создавать ложное впечатление. В примере (б) может показаться, чтобольшинство срезов через клетку, содержащих разветвленную митохондрию, содержат две или триотдельные митохондрии (сравни рис.
9.45). Однако изображения на срезах 4 и 7 можно интерпретировать как митохондрии в процессе деления. Истинную трехмерную структуру можно воссоздать из сериисрезов. (а, с любезного разрешения Stefan Hell.)блюдения под микроскопом. Зачастую в микроскоп можно поместить целую частьрастения или маленького животного почти безо всякой обработки (рис. 9.48). Затемпрепарат, приготовленный одним из этих способов, сканируют очень тонким пучком электронов.
Измеряют количество электронов, рассеянных или испущенныхпри бомбардировке первичным пучком каждой точки металлической поверхности.Эту величину используют для регуляции интенсивности второго пучка, движущегося синхронно с первым иформирующего изображение на телевизионном экране.Таким образом строится увеличенное изображениеповерхности как целого (рис. 9.49).Метод SEM обладает очень большой глубиной поля; более того, поскольку величина рассеяния электронов зависит от угла между поверхностьюи пучком, на изображении видны освещенные участкии тени, придающие ему трехмерный вид (см.
рис. 9.48и рис. 9.50). Однако так можно исследовать толькосвойства поверхностей, и в большинстве видов SEMдостигается не очень большое разрешение (около 10 нмРис. 9.48. Развивающийся цветок пшеницы, или колос. Этот хрупкий колосок быстро заморозили, покрыли тонкой металлическойпленкой и исследовали в замороженном состоянии в SEM. Даннаяфотография, полученная с небольшим увеличением, демонстрируетбольшую глубину фокуса микроскопа.
(С любезного разрешенияKim Findlay.)Глава 9. Визуализация клеток 1055Рис. 9.49. Сканирующий электронный микроскоп. Образец сканируют пучком электронов, фокусирующимся на препарате электромагнитными катушками, исполняющими роль линз. Детектор измеряетколичество рассеянных или испущенных электронов при последовательной бомбардировке каждойточки поверхности образца и контролирует интенсивность точек на изображении, формирующемсяна видеоэкране. SEM позволяет получать удивительные изображения трехмерных объектов с большойглубиной фокуса и разрешением от 3 нм до 20 нм в зависимости от прибора. (Фотография приведенас любезного разрешения Andrew Davies.)1056Часть III.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
