Часть 3 (1129751), страница 37
Текст из файла (страница 37)
Cell Biol. 76: 448–466, 1978. С любезного разрешения The Rockefeller University Press.)влияющие на функционирование клетки. Один из подходов — это микроинъекциямолекул в клетку при помощи стеклянной микропипетки.После микроинъекции в клетку антитела могут блокировать функцию молекулы, с которой они взаимодействуют. Например, анти-миозин II антитела при введении в оплодотворенную яйцеклетку морского ежа не позволяют ей делиться надвое,несмотря на то что деление ядра протекает нормально.
Это наблюдение говорито том, что миозин II играет ключевую роль в процессах сокращения, разделяющихцитоплазму во время деления клетки, но не требуется для деления ядра.Микроинъекция, хотя и широко используется, требует введения микропипеткив каждую клетку по отдельности. Следовательно, одновременно удается изучатьвсего несколько сотен клеток. Другие подходы позволяют одновременно делать проницаемыми мембраны больших популяций клеток. Например, частичное нарушениеплазматической мембраны клеток делает ее более проницаемой; для этого обычноиспользуют мощный удар электрического тока или химические соединения, напримерслабые растворы детергентов. Достоинство электрического подхода состоит в том,что он позволяет создавать в плазматической мембране большие поры, не повреждаяпри этом внутриклеточные мембраны.
В зависимости от типа клетки и силы токапоры позволяют проникать в клетку (и покидать ее) даже макромолекулам. Такойпроцесс электропорации также ценен для молекулярной генетики в качестве методавведения молекул ДНК в клетки. При ограниченном использовании большинствоклеток восстанавливает свою плазматическую мембрану и выживает.Третьим методом введения крупных молекул в клетки является слияниезамкнутых мембранных везикул, содержащих эти молекулы, с плазматическойГлава 9.
Визуализация клеток 1039Рис. 9.33. Визуализация концентрации внутриклеточного Ca2+при помощи флуоресцентного индикатора. Разветвленноедерево дендритов клетки Пуркинье в мозжечке получает более 100 тысяч синапсов от других нейронов. Сигнал от клеткипередается вдоль единственного аксона, выходящего из телаклетки внизу рисунка. Это изображение внутриклеточной концентрации Ca2+ в отдельной клетке Пуркинье (из мозга морскойсвинки) получено при помощи высокочувствительной камерыи Ca2+-селективного флуоресцентного индикатора fura-2. Концентрация свободного Ca2+ показана разными цветами: красныйсоответствует максимальной концентрации, синий — минимальной.
Наибольший уровень Ca2+ обнаружен в тысячах ветвейдендритов. (С любезного разрешения D. W. Tank, J. A. Connor,M. Sugimori и R. R. Llinas.)мембраной. Таким образом, их «груз» попадает вклетки. Этот метод широко используют для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих, например, ДНК для изучениятрансфекции или РНК для экспериментов с РНКи (описанных в главе 8). В области медицины данный подход применяют для направленной доставки новыхлекарственных соединений.Наконец, ДНК и РНК можно нанести на мельчайшие золотые частицы и выстрелить ими в клетку с большой скоростью. Живые клетки, поглотившие этипокрытые нуклеиновыми кислотами золотые частицы (их диаметр обычно меньше1 мкм), способны эффективно встраивать введенную РНК (используемую для изучения временной экспрессии или РНКи, например) или ДНК (для стабильнойтрансфекции).
Все четыре метода, представленные на рис. 9.34, широко используютв клеточной биологии.9.1.13. Свет можно использовать не только для визуализациимикроскопических объектов, но и для манипуляции имиФотоны обладают небольшим импульсом. Это означает, что объект, которыйпоглощает или отражает луч света, испытывает действие небольшой силы. В случаеобычных источников света такое давление излучения слишком мало, чтобы егостоило учитывать.
Но оно важно в космическом масштабе (препятствуя гравитационному коллапсу звезд) и, в некоторой степени, в биологической лаборатории,где интенсивный луч лазера способен давать достаточную силу для передвижениямаленьких объектов внутри клетки. Если луч лазера направлен на объект, чей показатель преломления выше чем у окружения, луч отражается и очень большоечисло фотонов меняет свое направление. Ход отражения фотонов заставляет объект оставаться в фокусе луча; если он начинает смещаться от своего положения,давление излучения возвращает его обратно, сильнее действуя на одну его сторону.Таким образом, управляя сфокусированным лучом лазера, обычно инфракрасного,потому что он меньше всего поглощается компонентами клетки, можно создать«оптический пинцет» для передвижения субклеточных объектов, например органелли хромосом. Данный метод, который иногда называют лазерным пинцетом, применяют для измерения сил, налагаемых отдельными актин-миозиновыми молекулами,отдельными микротрубочками и РНК-полимеразой (рис.
9.35).Рис. 9.34. Методы введения в клетку веществ, для которых мембрана непроницаема. (а) Вещество впрыскивается через микропипетку, либо путемприложения давления, либо, если вещество несет электрический заряд, путем наложения разности потенциалов, которая заставляет соединение идтив клетку с ионным потоком (метод ионофореза). (б) Клеточную мембрану делают временно проницаемой для вещества путем нарушения ее структурыкоротким, но сильным ударом электрического тока (2 000 В/см в течение 200 мкс, например).
(в) В замкнутые мембранные везикулы помещают нужноевещество и заставляют их сливаться с клеткой-мишенью. (г) Покрытые ДНК частицы золота используют для введения нового гена в ядро.1040Часть III. МетодыГлава 9. Визуализация клеток 1041Рис. 9.35. Оптический пинцет. Сфокусированный луч лазера можно использовать для захвата микроскопических частиц и целенаправленного их передвижения. В данном эксперименте такой оптическийпинцет используется для захвата маленькой кремниевой гранулы (0,2 нм, стрелка), покрытой несколькими молекулами кинезина (0 с), и переноса ее на изолированный мерцательный аксонемный комплекс,состоящий из микротрубочек (30 с). Видимое на рисунке яркое свечение — это отражение лазера от поверхности раздела между водой и покровным стеклом.
Кинезин на высвобожденной грануле (1 мин)сопрягает гидролиз АТP с движением вдоль микротрубочек, и снабжает энергией транспорт гранулывдоль аксонемного комплекса (3 мин). (Из S. M. Block et al., Nature 348: 348–352, 1990. С любезного разрешения Macmillan Publishers Ltd.)Интенсивные направленные лазерные лучи, которые хорошо поглощаютсябиологическими объектами, можно использовать для менее изящных манипуляцийв качестве оптических скальпелей для убийства отдельных клеток, прожигания иливырезания в них дырок или для отделения одного внутриклеточного компонентаот другого. Таким образом, оптические приборы могут служить базовыми инструментами для клеточной микрохирургии.9.1.14. Отдельные молекулы можно визуализировать при помощифлуоресцентной микроскопии полного внутреннего отраженияГранулы можно использовать для слежения за движением белков, но предпочтительнее иметь возможность визуализировать белки сами по себе.
В принципе, этого можно достичь путем мечения белка флуоресцентным маркером, либохимически присоединяя маленькую флуоресцентную молекулу к изолированномубелку, либо экспрессируя флуоресцентную химерную конструкцию (см. стр. 593).Однако в обычных микроскопах невозможно надежно регистрировать отдельныефлуоресцентные молекулы. Это ограничение не связано с пределом разрешения,оно вытекает из интерференции света, испускаемого находящимися не в фокусемолекулами.
В результате флуоресценция интересующей молекулы затемняется.Эта проблема решается при помощи специального оптического метода, носящего название микроскопии флуоресценции полного внутреннего отражения (Total InternalReflectance Fluorescence, TIRF). В микроскопе луч лазера светит на поверхностьпокровного стекла точно под критическим углом полного отражения (рис. 9.36, а).Благодаря полному внутреннему отражению свет не проникает в образец, и поэтомубольшинство флуоресцентных молекул не освещается. Однако электромагнитнаяэнергия распространяется в форме затухающего поля на очень короткое расстояниепод поверхность покровного стекла и, соответственно, в образец.
В результате возбуждаются только те молекулы, которые лежат ближе всего к покровному стеклу.Когда эти молекулы флуоресцируют, испускаемый ими свет уже не конкурирует1042Часть III. Методысо светом нижележащих молекул, и, следовательно, его можно зарегистрировать.Метод TIRF позволил провести несколько эффектных экспериментов, например,визуализацию единственного моторного белка, движущегося вдоль микротрубочки,или формирования и ветвления единственного актинового филамента. На данныймомент метод ограничен тонким слоем вблизи поверхности клетки толщиной около100–200 нм (рис. 9.36, б и в).9.1.15. Отдельные молекулы можно захватывать и передвигатьпри помощи атомно-силовой микроскопииTIRF позволяет визуализировать отдельные молекулы, это исключительнопассивный метод наблюдения.
Чтобы получить информацию о функции молекулы, очень полезно иметь возможность манипулировать молекулами как таковыми,и атомно-силовая микроскопия (atomic force microscopy, AFM) позволяет это де-Рис. 9.36. Микроскопия TIRF позволяет регистрироватьотдельные флуоресцентные молекулы. (а) В микроскопии TIRF используется возбуждающий лазерный лучдля освещения поверхности покровного стекла под критическим углом отражения света от поверхности разделавода-стекло. Некоторое количество электромагнитнойэнергии проникает на короткое расстояние в формезатухающего поля и возбуждает молекулы, лежащиевблизи поверхности. (б) В данном случае микроскопиюTIRF используют для визуализации отдельных молекулмиозина-GFP (зеленые точки), связанных с нефлуоресцирующими актиновыми филаментами (в), которыеневидимы, но прикреплены к поверхности покровногостекла.
(С любезного разрешения Dmitry Cherny и CliveR. Bagshaw.)Глава 9. Визуализация клеток 1043лать. В атомно-силовом микроскопе расположен очень маленький и острый зонд,сделанный из кремния или нитрида кремния методами нанотехнологий, сходнымис методами производства полупроводников. Зонд AFM прикреплен к гибкомукантилеверу, соединенному с высокоточной системой управления положением,позволяющей передвигать его на очень маленькие расстояния.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
