Часть 3 (1129751), страница 43
Текст из файла (страница 43)
Где происходит основноепреломление (основное фокусирование)? КакуюРис. Q9.2. Схема глаза человека (задароль, по-вашему, играет хрусталик?9.6. Почему люди так плохо видят под во- ча 9.5).дой? И почему помогают очки для подводногоплавания?9.7. Объясните разницу между разрешением и увеличением.9.8. Антитела, связывающие определенные белки, являются важным инструментом локализации молекул в клетках. Чувствительность первичного антитела — антитела, взаимодействующего с молекулой-мишенью, — часто усиливаютпри помощи связывающихся с ним вторичных антител. В чем состоят достоинстваи недостатки использования вторичных антител, несущих флуоресцентную метку,по сравнению с антителами, несущими связанные ферменты?9.9.
На рис. Q9.3 показан набор модифицированных GFP, испускающих светразных цветов. Почему, по-вашему мнению, один и тот же хромофор способенфлуоресцировать при таких разных длинах волн?9.10. Рассмотрите флуоресцентный детектор, разработанный для локализациив клетке активного фермента тирозинкиназы.
Синий (голубой) флуоресцентныйбелок (CFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP) сшиты с концами гибридного белкового домена. Гибридный белковый сегмент состоял из субстратногопептида, узнаваемого тирозинкиназой Abl, и фосфотирозин-связывающего домена(рис. Q9.4). Воздействие на домен CFP не приводит к испусканию домена YFP, еслидомены разделены. Однако, если CFP и YFP расположены близко, резонансныйперенос энергии флуоресценции (FRET) позволяет возбуждению CFP вызыватьиспускание YFP. FRET наблюдают экспериментально как увеличение отношенияинтенсивности флуоресценции при 526 нм и 476 нм (YFP/CFP), когда CFP возбуждается светом с длиной волны 434 нм.Инкубация репортерного белка с тирозинкиназой Abl в присутствии ATP даетувеличение испускания YFP/CFP (рис. Q9.4, б).
В отсутствие ATP или белкаAbl FRET не наблюдают. FRET также подавляют добавлением тирозинфосфатазыРис. Q9.3. Спектр цветов, получаемых при помощи модифицированных GFP (задача 9.9). (Из R. F. Service,Science 306: 1457б, 2004. С любезного разрешения издательства AAAS.)1066Часть III. МетодыРис. Q9.4 Флуоресцентный репортерный белок, разработанный для обнаружения тирозинкиназы (задача 9.10). (а) Доменная структура репортерного белка.
Указаны четыре домена: CFP, YFP, субстратный пептиддля тирозинкиназы и фосфотирозин-связывающий домен. (б) Результаты FRET. YFP/CFP нормированона 1 в момент времени 0. Репортер инкубирован в присутствии (или в отсутствие) Abl и ATP в указанных временных промежутках. Стрелкой показано время добавления тирозинфосфатазы. (Из A. Y. Ting,K. H. Klain, R. M. Klemke and R. Y. Tsien, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 15003–15008, 2001. C любезного разрешения Национальной академии наук США.)(рис. Q9.4, б).
Опишите, насколько можете, как репортерный белок позволяетопределить присутствие тирозинкиназы Abl.9.11. На практике разрешающая способность современных электронных микроскопов составляет около 0,1 нм. Основной причиной такого предела является маленькая числовая апертура (n sin θ), которая ограничивается θ (половиной угловойдлины лучей, собранных линзой объектива). Предполагая, что длина волны (λ)электрона равна 0,004 нм, а показатель преломления (n) равен 1,0, рассчитайтевеличину θ. Сравните полученное значение с θ = 60, характерным для световыхмикроскопов.9.12. Сложно отличить впадины от выпуклостей, просто рассматривая рисуноктеней.
Рассмотрите рис. Q9.5, а, на котором показан набор оттененных кругов.На рисунке Q9.5а круги кажутся выпуклостями, но на самом деле при простом переворачивании картинки вверх ногами (рис. Q9.5, б) круги начинают казаться впадинами. Это классическая зрительная иллюзия. Точно такая же иллюзия наблюдаетсяпри напылении металла (см. электронные микрофотографии на рис. Q9.5). На однойиз них кажется, что мембрана покрыта выступами, а на другой — множествомвпадинок. Может ли микроскопист с уверенностью сказать, что один из взглядовправильный, или можно выбрать произвольно? Объясните свой ответ.Список литературыОбщаяCelis J. E., Carter N., Simons K. et al. (eds.) (2005) Cell Biology: A LaboratoryHandbook, 3rd ed. San Diego: Academic Press. (Volume 3 of this four volume setГлава 9.
Визуализация клеток 1067Рис. Q9.5. Выпуклости и впадины (задача 9.12). (а) Оттененные круги, кажущиеся выпуклостями. (б) Оттененные круги, кажущиеся впадинами. (в) и (г) Электронные микрофотографии, расположенные так,чтобы казалось, что мембрана покрыта выпуклостями и впадинами соответственно. (в и г, с любезногоразрешения Andrew Staehelin.)covers the practicalities of most of the current light and electron imaging methods thatare used in cell biology, while volume 4 covers the transfer of molecules into cells.)Pawley B. P.
(ed.) (2006) Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd ed.New York: Springer Science.Разглядование клеток в световом микроскопеAdams M. C., Salmon W. C., Gupton S. L. et al. (2003) A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopyof living cells. Methods 29: 29–v41.Agard D. A., Hiraoka Y., Shaw P. & Sedat J. W.
(1989) Fluorescence miroscopyin three dimensions. In Methods in Cell Biology, vol. 30: Fluorescence Microscopy ofLiving Cells in Culture, part В (D. L. Taylor, Y.-L. Wang eds.). San Diego: AcademicPress.Centonze V. E. (2002) Introduction to multiphoton excitation imaging for thebiological sciences. Methods Cell Biol. 70: 129–48.Chalfie H., Tu Y., Euskirchen G. et al.
(1994) Green fluorescent protein asa maker for gene expression. Science 263: 802–805.Giepmans B. N., Adams S. R., Ellisman M. H. & Tsien R. Y. (2006) The fluorescenttoolbox for assessing protein location and function. Science 312: 217–224.Harlow E. & Lane D. (1988) Antibodies. A Laboratory Manual. Cold SpringHarbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.Haugland R. P.
(ed.) (1996) Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals, 8th ed. Eugene, OR: Molecular Probes, Inc. (Available online athttp://www.probes.com/)Jaisway J. K. & Simon S. M. (2004) Potentials and pitfalls of fluorescent quantumdots for biological imaging. Trends Cell Biol. 14: 497–504.1068Часть III. МетодыJares-Erijman E. A. & Jovin T. M. (2003) FRET imaging.
Nature Biotech. 21:1387–1395.Lippincott-Shwartz J., Altan-Bonnet N. & Patterson G. (2003) Photobleachingand photoactivation; following protein dynamics in living cells. Nature Cell Biol. 5:S7–S14.Minsky M. (1988) Memoir on inventing the confocal scanning microscope.Scanning 10: 128–138.Miyawaki A., Sawano А. & Kogure T. (2003) Lighting up cells: labeling proteinswith fiuorophores.
Nature Cell Biol. 5: S1–S7.Parton R. M. & Read N. D. (1999) Calcium and pH imaging in living cells. InLight Microscopy In Biology, A Practical Approach, 2nd ed. (Lacey AJ ed.) Oxford:Oxford University Press.Sako Y. & Yanagida T. (2003) Single-molecule visualization in cell biology.Nature Rev. Mol.
Cell Biol. 4: SS1–SS5.Sekar R. B. & Periasamy A. (2003) Fluorescence resonance energy transfer (FRET)microscopy imaging of live cell protein localizations. J. Cell Biol. 60: 629–633.Shaner N. C., Steinbach P. A. & Tsien R. Y. (2005) A guide to choosing fluorescentproteins. Nature Methods 2: 905–909.Sheetz M. P. (ed.) (1997) Laser Tweezers in Cell Biology. Methods Cell Biol. 55.Sluder G. & Wolf D. E. (2007) Video Microscopy 3rd ed. Methods Cell Biol.81.Stevens D. J. & Allan (2003) Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging.Science 300: 82–86.Tsien R. Y. (2003) Imagining imaging's future.
Nature Rev. Mol. Cell Rev. 4:SS16–SS21.Weiss D. G., Maile W, Wick R. A. & Steffen W. (1999) Video microscopy. InLight Microscopy in Biology: A Practical Approach, 2nd ed. (A. J. Lacey ed) Oxford:Oxford University Press.White J. G., Amos W. B. & Fordham M. (1987) An evaluation of confocal versusconventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. J. CellBiol.
105: 41–48.Zernike F. (1955) How I discovered phase contrast. Science 121: 345–349.Разглядывание клеток и молекул в электронном микроскопеAllen T. D. & Goldberg M. W. (1993) High resolution SEM in cell biology.Trends Cell Biol. 3: 203–208.Baumeister W. (2002) Electron tomography: towards visualizing the molecularorganization of the cytoplasm. Curr. Opin.
Struct. Biol. 12: 679–684.Böttcher B., Wynne S. A. & Crowther R. A. (1997) Determination of the fold ofthe core protein of hepatits В virus by electron cryomicroscopy. Nature 386: 88–91.Dubochet J., Adrian M., Chang J.-J. et al. (1988) Cryoelectron microscopy ofvitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21: 129–228.Frank J. (2003) Electron microscopy of functional ribosome complexes. Biopolymers68: 223–233.Hayat M. A.
(2000) Principles and Techniques of Electron Microscopy, 4th ed,Cambridge: Cambridge University Press.Heuser J. (1981) Quick-freeze, deep-etch preparation of samples for 3D electronmicroscopy. Trends Biochem. Sci. 6: 64–68.Глава 9. Визуализация клеток 1069Lippincott-Schwartz J. & Patterson G. H. (2003) Development and use offluorescent protein markers in living cells. Science 300: 87–91.Mclntosh R., Nicastro D. & Mastronarde D.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
