А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 29
Текст из файла (страница 29)
6.5). Иногда лля получения чистое культуры бывает постто тно одного васева в платную среду, однако чаще пассе в плотную питательную срслу повторя!от 2- ) раза. В качестве посевного материала при шом используют культуру, полученную из отлсльной копании. 6.2.2. Выделение чистой культуры из одной клетки Чистую культуру кз одной «летки можно выделить «гтлелыгьглг мешаем с помощью лглкроэгалггнуллвора, а также с ломощьго микрасеэеквора.
каимьамв метал линлнер . метов используют !три рабою с крупныыи мищюарганизиами! дршюшми, мицеливвамми грибэии, циансбактерилми, сади«ел» и. Порав к р бось след«юлил. Нэкопишльиую юльтуру рюаолят ь стсрплыаая среде с таким вветоьь чтсбы в исбольшш! «алле были ам!но шые глюки микргюрганизмаа Затем на паеерхнсс!ь нескольких стерильных покровнь х с скал стер гзьным стальяым ° срамив аса аа«а ге припто ы нага развем.нзв.
Гоголю прспарюь! аис!гвш кытля . Нанесенные ьа покрзвные стек!а капли п)юсматривают пад микрзскопсм и отмечаю с, в ка!орьа обнаружена толька анна юа:и:а. После этого пргаарат помешают в терисста ва елюкпую «зверу, кстсраи обычно сз!.си чашка Петри с уыажнсииод фюьтроювгюл буьаюя навис. Чсрсэ )2 — 24ч о меченные «а новь инкрсск пкруап Капли, в «старых иаблтюлаотся образование мэк)юколо иа, осторожна он«мают с наклонно!а !текле хусачюии стер! ль«ои фильтров«шьнак б ма! н переносят в про. б«ркп са стерн,|ьиои срсдои В ше е е ° тл«мх кзеюкс поиащью ми«Р мэнняулггвра.
Мвкраь!аиипулятар— прибор. повышаю!цап с иа аш ю пшшальноб иикроаэпстки или инкрацет.н изелгмгь изсуспензии оаиу«летку. Эо а р цв и ролнруют под чикгх««агом. Мик)юма ипул!пар иыеет лва аое!«писаных па «, моллу котаримь распсаожен гбычнмд микроскоп. На пред «зисы столике в крхжапэ установлена важная шмара, в которую гпмсныюг препарат «вися а гя ля .
и л ттказелях оперщнаиных штативов закрсплсни микропнпеш Гиггкропс н), лер ш оие «старых виоле зрения микро скопа оьушестют»с ьт~ с иа«рсплой очностью бзагодар» с сгемс аинюа и рычапн. Микропипешк аылзт ео втах ную камгру таки образом, чтобы их копны оказались в ! ноя»с» капле. Мсстело тгл , г я«я ~ г цос й к д г:си пепммк ереисс~гт их а прсбнр со стсргшьпшт жилкой срслсй.
йьцыиние етдельнмх «жгек с в «елью ишиас»лектора Певфгш са». Наибозес существенной чанъю нк>пес» «гора Пегч>гыьева явме с» с е» а Гю ап ляр, имсюшия с>рого пряноупжы о: ьсчеинс. Благоваря этаьш капал шппаляра хоро ыо просматраваетс» >гаке иииедспо нын обьсктиасм С срильный к»силл»р запалю иссзслуеьгай суспеизней кле~ок а агаризовалной пшюеж сй среде и три боз~ . шоч ушла сю и мпыюског а и»юлят учасюь е одиси щеткой, Спсии«гьнылг приспг ссблен ем эга у ас и лр Р Г викт а приемник, ю кшорхо заюм перенос с ср льпую савау. Микр:кевектар Перфильева некио нгпсльзони, для выселения шк кру и, к п ыслкит мньраорганг жгов 6.3.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСТОТЫ ВЫДЕЛЕННОЙ КУЛЬТУРЫ Чи г та выдел ннон кут туры ьшцюсргвнизмов должна быть пи»телы о проверена. Зто осущеп власте» обычно несколькими способами визуачьным, мнкроскоггичсскнь~ контре»ем и высевом на ряд шпатевьных сред. При визуальном конт>юле просматривается рост ьгикреюргапизмов во штриху на поверхности скошенной»с»пегас»анной оралы. Если рост по пприху неоднороден. культура загрязнена.
Такой контроль возможен тсяька для «ульт>р, способных рагли н» поверхности платных сред. Чипготу «ультур микроорганизмов обязательно нужно контрояшютнть под микроскопам. Для этого следует приготовить препарат фиксированных оцюшенных «легок и посмотреть сш с иммерсипнноп системой пли сделать препарат жнвмх клеюк и посмотреть его, исполшуя фазош>-контрвстноо устройство. Чистая кулшура многа» микрооршнизмпв, как правило, ьгорфологичсски однпролна; допустимо лил ль нсзиа »дельное шрьгг раввине разме>юв ьлсшк. Однако необходимо помнить, что ю>егки некоторых бактерий, например мико- бактерий, нокардий и др., очень полимпрфны, поэтому определение штстоты шких культур при микрсскопироаании вызывает некгпорме затруднению.
Чисз ° ту культур микрооршнизмов об»за>ельне проеерявп высевом на птпательиыс среды. Прежде всего выделенную ктльтуру пысевают на и>нательную среау, благоприятную ляя ее роста. Однородность выроавгнх «олений — свидетельспю чи«готы «ульт>ры. Обяза гелен посев на мясо пепзпгшый агар — среду, которая обесиечишст рюш многих хемогетерзпюфов. Кргперием чистоты «ультгры я»тщатся однороднпсп выросших кслонви или стсуштвие >юста, если данные микроорганизмы на мясопсптонном »гере не развиваклся. Следупг иметь в виду, чтп заключение о чистоте некоторых кулыур микроорганизмов нельзя слелать тслыго по результатвм высева на МПА.
Особенно зто касается автптрофных мнкрооршнизмов, а закис прсдшавителей гетероттофоп, склонных рюшпшться с одним или несколькими спупгиками Чистг гу таких культур микроорганизмов щюверяюг высевон еще на рлд сред — сусло, масон оптов вы й бульон, картофельный агар и лр. Набор сред и их состав опрелслшотсл особенностями метаболизма выделенных мгткрооршг > >гамов, а также ихгюзможныхспугников. Глава 7 методы количественного учетА микрооргднизмов О росте микргюргэпизмаз э еспкч венных субе! рашх шш в питателыгых средах судя~ по изменению количества их клеток иаи биомассы в елннице объеьм Методы определения зтпх показюшюб могут быль прямыми (подсчет клеток пол микроскопом, взвешивание) илн косвенны ми. Косвенные метолы основаны па измерении параметров, величина которых зависит от ксличеспж нли биомассы микроорганизмов (число каноник, выросших после посева суспензии югшак на питательную среду, рассеяние или поглощение суспензней сгеш, содержание в нед белка н т.д.).
Выбор исхода мвисш от целей исследования, свойств питательной среды !!ли сзбстрата, в также асобеяностей Ржчв н ьгорфслогии ыггк!юарганизмав, Так, многие мепзды, испольцеыые лля определения числа одноклеточных микроорганизмов, неприемлемы при напечете нпогокл винных (шпчатых, мицсли альтиях и ар. форм) При опенке чнсченнаспг микроорганизмов, особенно а естественных с!бе!ратях (прежде всего в почве), пегбхадиью помнить, что цх клетки часто нэхадптся е прикрепленном (эдге.
ировэнном) состоянии наи в анде ьшлракалоний. Поэтому перед началом полсчеш их ну-ого отделить от частиц с!%страха н лруг от друш (лесарбн ровать). Выбор метода лесорбпин (механическое норе нешнванис суспензпи клстогс, растирание, аб!нбсчка ультразвуком, применениее паверхнсстниьактивных «ещесзв и з.л.] ощэделяется сссбеннссшми нсследуемого субсцэтв. 7.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ ПОД МИКРОСКОПОМ Л;и паде гага юзвгок микроорганизмов пол микроскопом можно иапользоашь счез ные камеры, препараты фиксированных и окрещенных кветок, пригаазвленные ца прелмептых стеклах или мембранных фючглрал. Перечислепныс методы позволяют оггрввезппь общее количества «лшак в единице объелы (как живых, шь н мертвых). Основное огранвченпс бгиьшинстм уквюпных згстсдов — пе«бходимсстъ цовольно высокшг капцеъпрациб клеток в единице исследуемом! субстрата. 7.1.1.
Подсчет клеток е счетных камерах Эта метал рекоменлуетсл испольъзвазь л.ы цолсчегв крузгнъгх объсктоа-- .Оюжжсб, одноклеточных волоросэей. кон вдий грибов, некоторых относи!ельне крупнык бзьтсрнй. В «зчестве примера можно привести камеру Гараева — Тома ! рис, 7 1). Камера внешне ирелставгшсг собой толстое прсдмел к!с стекло, разделенное бороздками.
Центральная часть сгскла солержггт выемку глубиной 1,1 мм, на дно кг !араб нанеоена сюка. (лчбнна камеры (О,г мм) и площадь большггз н ммыз квадратов сегки (соответственно !/ц и '/геэ ммз) указаны на прельгстном стекле 10! ни Зююлнение мисры л недочет клепгк.
Прп рабспс с ° ! камера негбилгилю саба юээть определенные яра«ила се заполнения. Уп!Убленнс с сепгол покрьлпют специ ° ! альным шлифоэанным гакроаным сто«гам и, сэсгха ныесгороньдапсаюе р ю ср)сра п и!колец 11ма г анэ), с аилет ел ьстауюшел о том. ч го ш с« ~а пратерл к сгораням камеры. 1очька при чшсом усзоэии обьсм «амерь. соотэсгшнует расчепюму. Предэарительно кнмсру заполняют ассзслуемой суспсмией мик1ю организмов, очарую анссяг ка .иэл ром нли пипеткой.
Запгиненпую юмеру поыешаюг Ра столик микроскопа. Подсч "г клеток !юкалюнлустся начинать через 2 — 3 мин иос юпачг«чгю камеры. чтобы клетки осели, и при миююскопироюю1« находгшись э ол он плоско« и. Подаянные клыки перст:яиолнег!иелг камеры убишгют па. теснением ияи 0,5% м распюрзм форммнна.
Числокле о«юдсч ыю«пссбьект омб. 'ПО«), рсжо эбх Г. пипер«ионным обьектиэам работать целил, эк «як по рабочее р«сюянне меньше тол шинн стек ~з !амеры. Сбм аю рссчигмаанл «легки мнкроорганизмае а 10 бспьшга нлн 20 нюых кеэдрпах сшки, сзедрг Рис 7Л Счшнаэ «амера полиагонажг учигьлнют асс кчетки, дюкашие э кэ~ш — эалсгюме-. и б зе — сплю ы апра а.
пр аале стс исто клеток а бальор и ыо тесан инни л кра- шон каадратс е цоэжпа прсаышагь 20, з мшнш — 10, п прапгяном случае исюднра суспензию разэолят эгиоирзшжнои нсдап. Дли пол! пнин лссгоасрнсго результа. ю сбиюе чисто подочюшпюх ююгок ю крюршнммон дш~жгга быть н» менее 600. Поасчст «лшак пошориют 3 — 5 раз, юшшгзй раз юнпао ма!пируя камеру и заголи я сс суспензией милрсорганнзмое.
Эпг обссоочиаасг бсп шум точноспи чем подсчет 600 клеток прг. ошюкратном монтаже камеры. Коли ю«пю югспзк е 1 л последу«мои суспензнн ны лают по формуле лг = лб гда и — колич«сны клеток и 1 ил суспензин; а- ср анас коэи юстео глен к е кешлэгте сепги, Я вЂ” юпа «амеры, мм, 5 — площааь юлраш сспм, мм', 10' - юлэффишясгп персеода )с '! а !им'), л — «соффнцишп газ!«ясная исслслуемой с)«пензии. 7.1 .2. Кап илпярмый метод прямого счета ми«)запор ганиз ма в Длл подсчета ьгнкроорюнизлгон В.В. Перфильедым были разрабопгны специальные многоходоиые сч«гине капгилярш' с плсскиии параллельными стеклзлги (сьг. тя«же гл.
37). С)ни имеют прямоугольное сечение и по принципу подсчета ашшогнчны счепюй камере, их глубина н ширина определлготс» констр)кцией капилляра и прелгтаилянтт известные величины, а ллина обычно соотеетстаует лиаыстру ооп» зрения микрзскопа или может быть измерена. В от- *Гата Дя., Г Э Дд Капишарныс метода изуюишмакэааршнизюэ. - М.,Л« Иш ЛН СССР, 1ЗЬ!... С. 307 .-332.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
