А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 30
Текст из файла (страница 30)
102 личие от келлеры Горкевз в капвлллрзх Перфильеы люжно использомть обьсктипы с Волыним увеличением, в том числе нмыерсионпые, по позволяет подь впивать мелкие микроорганизмы. Попому такие капилляры е пр>шципе могут примещггься ллп подсчета лгикробных клеток п контроли роста бактерий в промышленной, пипсвой, а также медицинской микрсбиолоцги. Миогохоловые капнлллры представляют собой ко>>струк~вне иэ нескольких (обычно 5) параллсльньш капилларных лчеек, смонтированных на специальном прспметном стекле; клетки микроорганизмов полсчитывают в юскдой капиллврной лчейке, з Лла лальнейших расчетов используют усредненное число. При погружении капиллара в с>бстрат он заполнишсл нм в силу поил кагппларньп свойств. Затем кагпгплпр полгепшют па предметное стекло, заливают конец расплавленным парафином (что позшавет предохрагшть содержимое капилляра от высыхания) и подсшоывагот клетлп, используя обыктивы 40х, 90х или фаюво-контрастное устройство.
Длгг получения достоверною рсзулыига пслсчитыеают клсгкн в 50 — 1(У) полат эре>игл, подсчет ведут во всел юпилллрах. Количество клеток в 1 мл исследуемо> о субстрата определи юг по формуле а 1О' М= — --и, Ь(г( где и — количеепю кте ок в ! мл последу ого с>Оплата: а - среднее пю о ктшогг а юпнзлнре данной е лн» етр полн зренн», а — гл>бана хашиш>гю, лгм; ! — ширина шп юнра, мм; 4 . лнанетр псла эрен (панна капнлллра) нвн лзнном увюпегеннн мггштскопа, мм; ! 0> — коэффипне~т перс гла (см>1 з (ммл); » — коэффициент рамелен а исследуемою е>бс ра 3.
7ПКЗ. Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского — Брида) агат метод применяется в различныл ыодификацнях длл определении чнсиеннссцг мицюорганнзмов в разнообразных естественных субстраппг — почве, ашразпеннои воде, оптически непрозрачных средах, содержащил нсрастворгглгые в гюде колгпоненты, например крвтмал, ссевуго лгуку н т.д. 1!репмущество ме Юда заключаетсл тапке в тол>, что фиксированные окрашенные препараты могут долго храп нтьсн, поэтому полсчсг можно произвош":ть в улсб псе длн нсследовател» ерема.
Пр о врензрат . Хороню ссезвнтенное сред тисе отекло пс;шахт на мпшнметровую бумагу, на кето!юй размечен ра оугозьннк гшсгпзл ю 4 нзн б смг. Загс на «хо нанес>и точно>илеренный ошем исследуемо! суспензнн (Ю; 20 л ЗО мкл) н в не которых случаю кобам ахн лзплю 0 ОЗ -О 1%- и аолнога распюра ешр . Пм стенную суспыгзню рааномерн ласпрглелнют и>тлей по плошади, отмеченной на мшин апрогюй бумаге. Препарат полсушнвают на ноыухе, фикс руа г 10 — 20 мнн абсо потнь м спиошл~ (95') н охран.иаахп эра>розином, нстпле овы санни, фукса нем нлн лру м крас схем.
Затем препарат пронмванп, псслелогсш ю пшружю е кто а 4 — 5 сс улез е одой (промывать лол чюточной ведай не схелуег) н мсушпамот на ваз>>ухе. В акоп аале препаиц ы хсрпшо солранланса. Правила гюлечета. Прана!нт рыкснврунп е нммерсноннмм облектн о Прв это псисчнтнааю «гх~ггчмтю кте>о екадщштокушрной сетки, ксшрую по еш- 103 юг в окуляр межлу собира сл ой и главной лннзама. при пгсую анис!тки юлсчн ваяют испо клеток и иове зр н а микроскопа Правило пслсчета в кгилратзх скуяярнои солги то же, то н каалратах с г н счепюв камеры.
!юби реаль«в бьш лосз озерным, лвкн нкроорганизиов рско си«устоя пода нтышть в 50 — Н)0 Огнях зрение. Обшсс количество полсчитмшых кзешк нс лолжпо быть мс се 000. Кслн кспю ю!сток микрсорган зиса в ! ьш нсслслусмогс субе раш зычны пот по формуле ОБ Л( —. — а, зк глс М вЂ” кол ч спю «леток в 1 мл исслел!Омш о субстршэ; Π— срелнсе количество клеток в кюарата скулярной сьткн (поте зрения); з -.
плопняь кааарюз окуляриой ссгкн (пша зрея «), зм; !' — Объем нанесенной на стекло суспензия, 3; 5 — площадь мвз«а, м'; — козффипнеш рвзисдсню~ нсслслусмоп! с\б«трата. Плон!аль квалратв сспгп, или пол» зрения, опрсле тают с !юмотпью сбзектмикрометра, который попе!лают на столик микроскопа вместо препарата, и при том жс увеличении, прп котором пропалили подсчет, опреле шко сто(юну «вазр:па ок)зги рпой сетки или диаметр полл зрения. Площадь поля зрения вы . числлют по формуле я — и т. 7Л.4. Подсчет клеток на мембранных фильтрах Данный метов рекомендуется использовать шчя определения численности ыикрооргвиизмов в субстратм с низкой плотностью клеток. Его применяют при опрепелеяии копн капе микроорганизмов и различных швоемах, при сапишрпо-бактериологнческш и некоторых лрупгх исслспоеашшх.
Фгшьтромние пробы известного объема (ст нескольких мшшилитров ло литров) позволяет око ил ентрирпвать на поверхности фклы ра сопсржащиесв в пробе клетки микргюрганизмов. Зшем их окрашивакп и попс ппыштют. Прнготоа.инне фш ьтра. Для фиан Фшнния выбирают фильтр, размер пор «Отошжо позяолвс! залержинэть мнкроованго ш, нахаяяшиссл л сфстрате. Хзракшристиш мсмбранньж фяьютра привалена в гл. 4.
Перел спел зов исн фильтры кипятят а листнл! игошиной эоле юл улшзенил иозлуш и Оста «ов распюрпшлсй; голу елслуег 2 3 раза смени ь (ьиляченнс е вол' на бить слишком б>рным, иначе фнлыры бутуз скручива ьсл). Затем фнлыр помегшаот на спепнмьный лержэтель матовой стороной срх и пропускаю че!жз нсш ы»аю измеренный объем пробы 1лсл!юбнсс а техника фильтрования через мемб!янине фильтры см. ш 4). Чем бслызе плопзост тоь а исс.юлуемом н терн лс нбпь всш слусмыи сбыьт, и наоборот. Клетки микрсоргашззмов, осевшие иа фильтре, окрашивают карботовым зритрозн о Для зпзго фильтр помешают нихгнсй стороной в чашку Петри на филыровальную бу агу, увлажненную красителем, чашку заарыввот крышкой а освю лют на 3 — 5 ч или на сугки Д:зл равномерного окрзшн инна клеюк мсмбраннь й филыр лолжсн сломю яры~сыть ь бумимному ф оиру с зр грози ша.
Зэшм мембранный фкчыр шин шюг ш «раси«азат, персюилышя его в чмпки Пшри с фнлыро а юной буьзагой, обильно с оченпов лкс игчирошнной золой, ло шх пор, пока он не пересвист се ол!вонзать. 1 (сслс оп ыюизия фтшьтр аьгсушишюг ~ьз вОзлухс и уловят препара лл» миьзюскспии. и» Орет!метисе сзсклс наново каплю кммсрсно ш ьыслл и помешаю на ш окрашенный мембраннын фш~ыр зак, 'нобы кшткн мнкрооргашомсв бьшп сырху. На псгсрхнссгь мсмбрантюго фнлыра наносят ени мплкз ммсрсионного масла покрывают фильтр по«ровным стевом. Правила подсчета. Коли'юство клочок ннкрсорганпэиов подсюпыамог с нммсрснонным обыкпп ом 90» э кнюратаь окулнрной сетки нлн в поле зрснна микроскопа.
Правила поле !сча анмюочны гем, ы:тсрьм гпложены ллн метсла Вннограаского— Ьрнда. Кчжнчсстло кчсток ! л с сдусна!о субсгрэш ! сплю по фор уэе г !о' и ле Д вЂ” олк о юс о«в ! мл исследуемого субе!рата; — срж сс колнчсс ео кчсток н к эдрате окулярной сетки (поле зрения]; Л вЂ” плошадь нембр! но о фалыра, мм; !' — об см проф оьтраванной жядкосп, ьм; !и! — «оэфф ш с срс ода !. кь! ), г — лою:ы к ээрата окучярной сетки (псла эреннэ) При выяыснии и колпчестэешюм учете микрооршннзыов ши!юко приьченнажлюмннесцснтную лгнкроскопию (сц. гл. 5) Препараты ьгикргюргапнзмов готовят непосредственно иэ исследуемой суспыыии или ее разведения либо конпентририш клетки на специально обработанных нефлуореспнруюшик фияьчтжт.
Препараты и фильтры с микроорганизмалги обрабатывают вкриднном оранжевым !ми лругими флуоресцирующнмн красителями. Принципы полсчста при светлопсльнои и люмннесцсгппой микроскопии опинаковы, однако окрашенпыс бчлуоршроэюми клетки белее четко видны на темном фоне прела!нта, их легче отличить от небиологическнх обьектов ( юстиц ила, по гвы и т.д.] и орогпвссги подсчет болсс точно. Люминесцентная микрюкопнв даст также возыод ность выявить и оценись в исследуемой пробе э!голень!ость отдельных групп микроорганизмов. Для шо го применянж специальные флуороьромы (например, калькофлуор бслый— взя выявления грибов), ьчетод иммунофлуореспешп|и и др. 7.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ ВЫСЕВОМ НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ В отличие ш подсчета ьгикрооргэниэмов под микр<ккопоы этот метод дает вэзможносп определить только число жизнеспособных клеток н популяции.
Поскольку сред. пригодныь для роста всех микроорганизмов, не существует, чсгол высева паст воэможность опреяслить лишь число микроорганизмов. способных расти на среде данного сссгюж, причем нс позволявг и!сотые ыикро. организыы, которые нс раст"т (например, твк нэзьгвасмыс жизнеспособные, но не культивирусмые формы) или растут очень медленно. Это важно помпгпь при анализе гакнх естественных субсгратол, клк почав, во)в н т.
п. 7.2лЕ Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды [метод Коха) Мстол ширэко применяют лля определении численгюстп жизнеспоссбяых ючсток в !жзлнчных ссюшвеичгык субстратах н в лабо!вгорных культурач. В сш основе лех ит прянпип Коха, согласно которому квжчая колония яюшегся потомством одной кэегки. Это позлоляст на основании числа колоний, вырос- ших после посева на пыш ную питательную среду опрелеленного объема исследуемой суспензин, судить об походном солержаншт в ней кяеток микроортннизмов. Реэультнгы количественного опрелеленця микроорганизмов, проведенного по методу Коха, часто выражают нс в числе клеток, а в условных, тик называемых кслонисобразуюших едини! (ах (КОЕ).
Определение числв микроорганизмов зтиь! моголом включает трн этапа: приготовление разведении; посев на плопгую среду в чашки Петри и допечет выросших колоний. !.Прнгсча епнеразведснии. !исленность юпуллц им крюрганизмовобычногюлика, поэте у пля пал) ~евн» изолированных колоний соб ол о пр готошнь ргш пошел еэтсльннх разеепсний.
Разгсдения гг опят в стериль ой олопровслной воде нлп я О 85В и распюре Ма(5 (фгтзиоло~ ичсском раш воре). В мшс опьпэ цезссосб)из о пспслыонпь один и зот же коэффициент рэзеслснил, например 10, зш уменьшает асроя псстьошнбкн. для пригстоюсниа разэс ~гэня сгсрильь у о подппртпгиную швб рмлшпгот по 9 мл а стсрилып сухие пробврки Загсм 1 ил исследуемой суспензи сп:рпль ой пипеткой переносит н он!бирку с 9 мч пгрилыюя шкап — зто первее разгедснис (1О' ). Пгму кц. нос разесленис пиатыыю нсрснешпги!о огюн стерильной пипсз оя, с л кг раз гбн1ыя в пипетку выпуская из пес полученнуто суспензию клеток. Затем той жс пи пс ои отбирак 1 мл суспснэии и псглиослт ы втору нр б р«у, п луч я е врое рады!сине ПО ) Таким же образо гозшш пес глуюшие развеленгя Стсос раз дс л маис ат .
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
