А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 32
Текст из файла (страница 32)
Эксикатор ставят около аналитических весов, на которых оудет проводгпься взвешивание. Через час фильтры (пензрифужные пробирки) взвешивают с точностью до 0,0001 г. Высушивание и взвешивание повторяют, соблюдая указанную последовательность операций, пока масса не достигнет постоянного значения, г.е.
колебания в ее определениях не будут превьп пать десятых долей мг. 2. Отделение микроорганизмов от среды возможно центрифугированием или фильтрованием. В центрифужную пробирку наливают точно измеренный объем тщательно перемешанной жидкой культуры, который в зависимости от ее плотности колеблется от 5 зо 20 мл. Время центрифугирования и число оборотов зависят от размеров клеток.
Чем опи меньше, тем больше требуется оборотов и тем продолжительнее должно быть время центрифугирования. Чаще всего центрифугируют 15 — 20 мин при 3 — 5 тыс. я. После центрифугирования надосадочную жидкость осторожно сливают, осадок промывают слегка подкисленной дистиллированной водой (1 мл концентрированной НС! на 1 л волы) п снова центрифугируют при том же числе оборотов. Супернатант сливаю~ тотчас после остановки центрифуги. В противном случае часть осадка может быть потеряна. Мицелий актиномицетов и 1рибов отделяют фильтрованием.
Бумажный фильтр помешают в стеклянную воронку и фильтруют через него точно измеренный объем культуры — от 5 до 10 мл. Осадок на филю'ре многократно промывают подкисленной дистиллированной водой. Для отделения бактерий используют мембранные фильтры. Размеры пор мембранного фильтра должны быть меньше величины клеток, биомассу которых определяют 111 (юраьюрисп ку фильт1юв с. л 4.). Иеыбраипый филыр помешают ив псристуюпласпшку с«с«пышны' 1 ге, огз в колбу. Чтобы ускорят ф л рова«не, ус в~ оаку па«ключа«я кволое рулигыу насосу, («елок «се«ольке газ пгюмыыют пслкислеи «ой водой. Пол робио пор ыок работы с нем бравиымн фы ьтрз ми см.
гл. 4. 3. Оврелелеяве биомассы. Чтсбьг опрелслнгь ыассу сухих клеток, центр фужную пробирку или фнжлр с спыкоьг клеток ыпкрсоргмгизмав помещнст а сушиль«ыи шюф, высуш~гы««г взвешиваю . Р ж у ~ и п: же, что исполь:ювааи «пр«оппглелеиии массы пробирс«гы ф л ро . Сухую бло ысг опрелсляхп по формуле (А — В) 1000 1' гле Я вЂ”. сухы биомасса, гл; А — маска не«грифу«иав лр:6«ркгг (фгшьтра) с осач. ком, г; Я вЂ” масса центрифужноа пробирки (ф пыра) без сс л, ц У вЂ” объем «улыурюгьиой кгшкосп, юлтый мы цеггтрггйжп роеания (ф л го инин), мл. тсчнсшьмеыла опр Люлпсл полнотой сть:ываиил клс ок от компонентов спелы в плательиостъю ювсшиаанпя 7.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК И БИОМАССЫ НЕФЕЛОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ Оптический (нефеломсгрический, турбилимегрический) метов определения биомассы нашел широкое применение в лабораторных микробиологических ныледованиях, поскольку гюзволяет быстро н довспьно точно опрслслить концентрацию клеток в суспснзии ияи культуравьной жидковы.
В основе метолв лежит измерение ослаблеяия свеывого пучка при его ~рохожлснни через суспензню югеток. В определенных прслелкт оно обусловлено преимушссп«нно рассеянием света клетками и пгюпорцноналъно их концентрации Величина этого показателю зависит от мнопгх Факторов (формы и раза~еров клеток, оптических свойств культуральной среды, клины волны света и т. Л,), поэтому нефелометрнческий метод прпгопсн лшпь Лля тех микроорганизмов, рост «спорых вызывает равномерное помутнение срелы и не сопровожлаетсл звмегиым изменением формы и размеров клеток, обраюынисм мннелия.
пленок пли других скоплений. Литашльная среда лзя кульпгвнрования микроорганизмов, в которой прелнолагастся опрслелать число кгсток по свсторассеянию, лолжна бьггь оптически прозрачной. Изменение ннтенспвности сыпг при прохождении через суспензню «лящк измеряют с помощью нефеломсгра, фпозыктроколорнметра (Фэк) или спектрсч)ютоьгщра, выбирал шшну вогны (обычно в цнтсрыле 540 — 650 ньг), прп «оырой поглощение света данной суспензией клеток ьгиинмальнсе.
При высоких концентрациях шесток в культуральной среЫ происходгп вторичное рнжсян«с сыта, цо приводят к зан лже пню результаз ос. Правила рабан г на 4«поэлектроколаримсгрс полробгго изложены в янструютин. прилагаемой к прибору. В некоторых случаях плотность кчвючной суспензии вырахшют в показателях нефелометра, Овнако юще стрзят калибровочные кривыс межлу вели юной свсторассеяния и числом клеток пли сутой биомассой в единице сбьема. Пал построения калибровочной кривой псступакл слелующим образом. Излге- 112 ряют величину оптической плотности суспензий с различным содержазпгем клеток и в каждой из них определяют одним из применяемых методов количество клеток или биомассу. Полученную зависимость вгяражают графически, откладывая на оси ординат показания ФЭК, а на оси абсцисс — количество клеток, содержащихся в 1 мл суспензия, или биомассу в г/л.
Для каждого микроорганизма следует строить свою калибровочную кривую. 7.4.1. Стандарты мутности и их применение В ряде случаев количество клеток в суспензии бывает достаточно определить визуально путем сравнения со стандартом мутности. Стандарты мутности представляют собой взвесь частиц стекла пирекс в дистиллированной воде. За единицу стандарта мутности условно принята мутность суспензии (в физрастворе) бактерий — возбудителей тифа с концентрацией клеток 1ОО млн/мл. Стандарт мутности включает 4 эталона на 11, 1О, 9 и 5 единиц, что соответствует содержанию 1,1 10"; 1 10~; 0,9 10" и 0,5 1Оз клеток в 1 мл взвеси.
Для определения количества клеток пробирку с исследуемой суспензией ставят рядом с эталоном 10 и рассматривают их в отраженном и проходящем свете на фоне белого листа бумаги, в центре которого нанесено несколько черных линий. Эталоны 9 и 11 вспомогательные, позволяющие более четко сравнить мутность исследуемой суспснзии бактерий с эталоном. Стандартизация мутности суспензии бактерий (особенно часто в случае тест-организмов) имеет существенное значение при приготовлении посевного материала в серийных опытах, например при определении антибиотической активности препаратов методом диффузии в агар. 7.5. ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ Первоначально прибор и метод проточной цитометрии (Г!оч су1още1гу, или ГСМ) были разработаны для подсчета форменных элементов крови.
После соответствующих модификаций этот прибор стали применять для подсчета клеток микроорганизмов (одноклеточных) сначала в водных образцах, а впоследствии и в почвенных. Принцип метода основан на регистрации сигнала (светового, электрического) при прохождении частицы по капилляру.
Если разные клетки рассеивают проходящий луч света по-разному, то можно дифференцированно осуществлять учет разных клеток. Однако в любом случае будет регистрироваться как проходящая клетка (живая или неживая), так и любая другая частица.
Чтобы избежать этого, перед учетом клетки в образцах сиди окрашивать специфическими флуоресцентными красителями. В этом случае учитываются только флуоресцирующие клетки. Если суспензию окрасить разными флуоресцентными красителями, различно окрашивающими. живые и мертвые клетки, то появляется возможность вести дифференцированный учет живых и мертвых клеток в одном образце. Современные приборы измеряют несколько характеристик прохолящей частицы: переднее и боковое угловое рассеяние и флуоресценцию при разных длинах волн. В качестве источника света при освещении (возбуждении) объек- 113 та и регистрации испускаемого света используются: холодные» лазеры с длинаии волн возбуждающего света, соотввгствутощвх голубой части спектра, и красители ( шще всего нуклеиновых кислот), хщзактерисгьгкн которых как раа ссотвсгпгвуатг этим длннатг волн.
Переднее угловое рассеяние регистрнрунп с помощью дводного детекго!ю, боковое угловое рассешню н флуоресценпвл !югистрируются фотоумножителями. Пплучаеьгые результаты аншпгзируют с помощью соответствующих компыотерныл программ (УУ)пМП)! Зсаерй Тоцег, 5ащ Пищше Гог В!о!орса! Вшдгеа, Ев)о!!а. С!ПА; Опрг//Ьсв.бспрра.едц/ итбмаге.От!я)), которые разрабатывакггся изпповителями цнтометров (Вес!оп ПюВпаоп, США), шш лругвмн компюптяьги (Опрг/Дсыпгапц.едц.ац). Результапя подсчепа клеток обычно прелстанлнкл в логарнфмическом ьюсштабе пос.
ле соотнетспгуаацей стапгстнческой об!юботки. 1(егеа нсеолюо апиеь1 прг о шого шгюметра произ одятсл еегг настроика н калибрсою~ ггу~си прогйсканнв ср:пе тни, содержащей юшстнос холгг'гешво к сток, с рвт ными с ттюстячн прото . жвлк ап — обы шо ст Шдо 90 лгкл/хин ел чение несколь. кнх н но дла учша текамегшуетс» нспользонпь суспенз и «лс ок, содержагд е Ло 10» юг/ьш Провалю учш ат 5000 до Ю РМ ктеток. В качестве и утреннегс стандарта а ксслелуемне обратны рекс сиду сп добашнть (в сб стае до 10 ьгкл при сб еш: несла. лтемоп образца 1 мв) суспентию, например желто-зеленых чашвчск латекс Рпмс- 0,7 -0,9 мкм (Ро1уш)енсе, Ерреше)ш, ФРГ), так чтобы кааечнгю нч количество гоглаюшс цо !От ~асгачеюмл.
Дле предотвращение ошибок, еотннкаюш х из-за не'пец ф ской пв лрнролнай флуорссценпни объектов (иаприм р, фгуоресценпня ююрш)вон|а т.л.), иш!сльтуют согчаектвуюна с фитьтры, ко орне ло ломают ~акую фгуореспепп о. Пптшчнмс цптометрь1 прошволят н разных странат, е чшп!с тн в США. Пргпочный шп ыетр Рдсбсайш (Вес!оп Р~св!гьчю!шшн ссушшетп буиегпт, Вае зсю, сшд) снабпен ваааушно-ошюкааеьгнм ар! оновымлатертм мопгносгью 15 мВт пр 488 вм н сори ру~о!пеп ю и трубкой-лову хетт.
Широко ггспальзушси лрсточьий цнтоьюгр ер1с5 541 (сотвтег со., ншеав, сшА), обортлошнньа бнссенсо!юм прошллших «т» ок и менее раиеаюегписв патерам (Сойсп: ! (плота 90) мшпно пыо 0,5 Вт, соыаюш в луч слега сшнлой мни взавис масти от натользуем фл)орссцвруюгчнх красите. й е интернате о 488 (для красителей УОУ0-1, УО-РйО-! ити Рюоагегп) да Зтз — 357 нм (вля мюсигелеа ноесь! 33342 и пАР)). скопить учете е такаьг ц юмстрс тюсп ш т 1ООО клеток е ткунду, олнако рекоменлуетеа испсаьзоеать скамкш счюа не более 300 клеток а секунду.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
