А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Зто высуш иванне и исследующие:пвпы подготовки образцов лля СЗМ, опиглнные ранее, прогюдят с помощью специальных приборов в лаборатории электронной микроскопии. В целях изучения архитекюники колоний микрооргвнюмов пх выращивают на поверхности стерильных мембранных фильтров (например, Владипор Рй 2 — 5), помещенных на соответствующую агаризоаанную питательную срелу а чашках Петри. Выросвгис колонии псщвершют фиксации и обезвоживанию, последовательно пшгещая фильтры в чашки Петри, крышки коюрых покрыты вн)трн фггльтрошыьггог) бумагой, щюпгпаннои слелующпми веще. сгаамиг 25)цг) глутаравыя алшепгд (на 30 мин), безводный ацетон (2 раза по 20 ыин).
После ВКТ, приклеигпния к объектным столикам и напыления металлом колонии исследуют в СЗМ. Экзсспоры ашнномицетов и грибов готовят к иссясдовацига в СЭМ следующим абрахом: к споронссюасму щплушному мицелию осюрожно прикасаются поверхностью объектиога сюлша, покрьпог о лаком. Полученный гппечаток пекле подсуш иванна на воздухе напыляют мета пюм в ионно-распылитеяьной установке.
В.4.3. Сканирующая зондовая микроскопия В ) 9В2 г. бьы разрзботмз оринцнпиаяьно новый метоп субмикроскопического, с разрешением ло лешей нанометров, июледованггь поверхности обтектов, расположенных на диэлектрических подложках из слюды, графита и других материалов, благодаря воэнишювению между изучаемой поверхностью и специальным зондом особых (зуннельцмх) токов. В качестве зонтов используют платиновые иди вольфрамовые игяьг. Различные способы сканирующей туннеяьноа, атомно-силовой н друпш видов неразрушающсй зондовой микроскопии основаны на иНых физических закономерностях, чем электронная микроскопия.
Методы сканлрягомеа юядоаоБ микроскопия исткшьзухп для полученгш предельных разрешений поверхности, вплоть Ло топографии на атомарном уровне. По дсстигиутому разрешеникг (лола нонометров) эти методы сопоставимы лишь с рснтгеасструктурным анализом, на в отличие ст него не требуют крисшллизапии объектов. Образцы це разрушаются элсктронамн высоких знерпгй, как при тралицноциай зггектронной микроскопии. Новые ые тоды исследования в наноьгсгровом диапазоне нашли широкое применение в материаловедении, для исследований металлов, полупроводников, диэлектриков. полимеров, плеиочньш структур, молекулярных кластеров, гюрошков, лля контроля устройств хранения информации, положив начало бурному развитию нанотехнологий, а также аалябиглегли С помощью этих методов получены уникальные данные о строении нативных биологических обьектсиг— вирусоп, бактерий, архей и отдельных структур разных живых «легок, например, жгупгков, пилен, рссничек, а таьлге ферментов, нутшеиновых кислот, антибиотиков, токсинов, о кииетике некоторыь биологических процессов.
Ддя иссчсдоыший биологических обьектов, атом чисчс и микроорганизмов, с помощью скзнирующей зондовой щгкрсскопии гмзработаны рашичные моделе микроскопов. Например, фирмой НТ-МЛТ (Москва) — одним из мировых лидеров в этой области, созданы универсальные «Сзшвер Р47Н», или Озлвер 92 Р47БИОь для исследования живых абьектав в биологии и медицине.
Это коли лак пгые (не более 50 см в высгау) относительно гтргкт ые и недорогие ггта сравнен«ю с электронными лен«рею«опален) приборы, сстлиненные с компьютером, обрабатмеающим получаемую с помощью зоила лгнфюрлгащгю и всспраизаодвдщм ее в виде файла анапопегно цветным географическим карпгм. на которых высоту изучаемой поверхности абсзначщт уславный цвет. Вьпюа июбраже.
ння на печать праимюшпся в внле трекмериг«о изометрического рисунка с ука. эанием щлнчин всех парамгчрал в рщльнслг масппвбе агемени. Эпг и лрупге подобные приборы обеспечивают широкие возможности неразрупающих иссчедоаанай живых «леток и некоторых арохолящнх в них процессов с разрешением ог микромегровога до атомарного а рашичлы« окружающих условиях. Разработан подобный прибор «для научна-сбриощтельиога процесса в области ианотехнслсгий и нанабиалагии — Надо Бйпсатог С его помощью возможно ищчение поверхноспг щиток различныт микрсюрганизлгов, ачгезии этих «леток, ггордащ укладки и величины, ориентации в прсстранапм белковых и лругпл глабул иа поверхности клеток, эндоспор, в составе вюпачеиий различ.
ных бзкэвргщ, процессов вэаимолействил биологдчески активных сселинений с микробными кленами. Такие исщеловэняя можно провалить в капле лиаксати с бнологичесювщ сбыктвми, расположенной на диэлектри гескаи подложке Глава 6 ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ Фнзислогию, биохими какие свойства и циклы разыпня льикрооргангамов исслслуют, как правило, при работе с чистыми культурами. %гееной, или оксени вской, назыеакп «улыуру, солержашую микроорганизмы одного вила. Умение выделить лгикроорганязмы одного вида нз сметпаннай популяции, существующей в природе, н поддерживать чистоту культуры — необхолимые условия работы с мнкраорщниэмами. Вылеление чистой кулыуры обычно аю~ючает три этапа: г) о.учтте никооитщ ной культуры, 2) к ден ние чисгной юньтуры; 3) онреденение тюноты еыдегенной «улынуры.
бсБ ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ Нокоггите теней называет такую культуру, в которой прсобладакп представители одной физиолоптческой группы или даже одного вила микроорганизмов. Метод накопигельньт кучьтур быч веелсн в практику микрсБгятчгггиче слих исследований С.Н. Виноградгжим и М.Бейерником. Сущность его заключается в сшщанилг эмктиеных, т.е. избирательных, условий. которые обеспечивают преимущественное развитие желаемых гнеобхолгглгых исследоыпелю) млэкроарганлгзмов ияи Пэуппы микроорганизмов из сметанная популяции.
При создании элективных условий необхавимо знать физислопао или четка представлять те особенности, когорымн должны обладать выделяемые микроорганизлгы. Электавные условия создают чаще всего подбором соотвстсгву- ХеюающетрФлсю бюппюв гет ююнстююнн услаенс Пр Ювннпю но СульФатХОГ гюнюп ры Есатйнгнлюв* бэ рв Мею— Сол элекоюно — сбр уюю вртгю Хюавапаааппреб е бает р Субстсаты» ПП* . АМсэю ю ЫО, М Аюйг б, ~От- РЭМ Ю, Л ИННЬ ГГ Пт Вюоуолггые б к Рвн АН Р бпйе б, б От ТаИ Прй бсеыуЛСаы у л йна беО югсюгюй~юу пг Р г юн ейюггбюаю Рнс, бб. Основные баюнтры, опрелсллгошне получение гюкопнтельныл культур неинпрыл групп бактерий Фю Р. Стсбннеру н лр., ! 979) Опт с ае ссре а рп- ннчесююсс лнГюээй+ СО, Атр:бные уюаюкв эю гена» А:-рсбнне юа*равсатеры, юн ср лююо сн Аэр бы„ н Ремер Р йаоюею ДеюпрнФн- юанюлюс бвю рнн СЬ Ийаю Ран П атюа еюнные сил баг.
Рен, сэу а н. бг кейне, на ример Вю1н Ц»ИО- е г --' лзэ ь и сг Ф»л 5' я О*сит»»Ж Сэ в РО- г», юнеЕак еи » а Сот х «эле и н «у1леэ н Эемн В ее минта.- е Я.! л юсе» сг»ьФю т. к Р г и»т~ Нюк»а О "э эвеи птелт! Н евл Ое авэческэе сыа « Птзлзр н э. Еэю е» Р р Ение упюи Рнс. б.!.
Ппйигжг Ющгп сред, поскольку различные мицюорганизмы для своего развития прсльявэяют неодинаковые требования к источникам питания. Например, микроорганизмы, способные фиксировать мщ~екулярный акпт могут расти в среде, нз сссгава которой ноюпочены свяэаниые форыы ахша. Если внести в щкуго срепу почву, то из громэлнаго разнообразия имеющихся в ней микрооргащтзмов в первуго очередь будут разшпмться азстфиисаторы. Накопительнь|е кулшуры автотрофнкл микроорганизмов получавтг на срепах, где елинственным источнилхы углеропа служит углекислота.
Отсутстмю в среде друпгх соединений углеро. за задерживает рпшгпге г етерсплофов. Такие специфические питательные срезы, юговлетворяющис потребности преимущественно одной группы мпкрюрщнязмов, носят название ыекмлшььт. В зарубежнойлитерюуре большее раепрои",нгшнгге полупшя щрьшин «эамэпааеннне», нли «гегеи ее»не, средьс Иногда при выделении мнкрсюргэнизмов нз природных популяции в среду включэкл антибиотики, которые отличаются специфичностью действия и позмзэ нот избирательно гголагшять рос опрелеленной группы микр гргляизмон.
Так, элсктивные условия для развития грамотрипатсльных бактерий можно созэлвать внесение»~ в среду пеницющина в концентращгп от 0,2 до ! 00 мг/л, поскольку а~нагие виды грампояожительных бактерия при этом или совсем не развивалпся, нлн развиваются медленно. Чтобы создать благоприятвые условна для развития бактерий н, напротив, полавигь роог мнцслиальных грибов, к средам рекомендуют добавлять ниспп ин в концснтрашти от О, ! до 20 ьп/л пли гризеофульвин в «онцеятрации от ! до 20 мг/л. Прн вещании элсктивных условий следует учитывать неодинаковое отношение различных микрсюр1анизмов к аэрации, температуре, кислотиости срезы, освещению и т.д. Поэтому при получении накопительнои культуры аэроб- ных микроорганизмов обеспечивают большую поверхность контакта питательной среды с воздухам, а для обогащения среды анюрсбнымн мнкрооршнизмами тем нли иныл! способом создают анаэрабные условия.
Кульгиеироыгнне при высокой геьщературс (50 с и вьплс) исключает развитие ьгежх)гнльньгх мпкр организмов и обеспечивает рост термафнлов. Селсктивиым фактором может слукггть также неодинаковая скорость рааш различных мпкраарганизмов при ланной температуре. Например, в ряде случает изсм различий в апти. мальных температурах роста на минеральной срелс прн освещении и температуре 35 С удается почти полносгыа подавить рост зеленых водорослей и гкщучнгь кульпру, обогащенную пнанабакгериями. Пра поят юнии накопительных «ультур следует учитывать и такую особенность микроорганизмов, как спасабщкть к сбрачоваг гию эндсспор.
Дюг накопления спараабразуюлгггх бактсрн!г среды инокулпруют, как правило, субстратом, который предварительна пастеризукп, т.е. «ражовремснна прагресают прн высокой»емпературс (1О мин при 75 'С или 2 — 5 мин при 80 С). Таким образом можно полностью юш почти пслносп ю исключить развитие бактерий, нс образующих споры.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
