А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Поэтому белковые включения часто называют параспоральными кристаллами. Их окрашивают с помощью красителей, хорошо связывающихся с белками, например амидошварцем или анилиновым черным для шерсти. Для выявления параспоральных включений готовят тонкий мазок спорулирующей культуры, высушивают его на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и в течение примерно 1 — 2 мин окрашивают одним из вышеуказанных красителей, следя за тем, чтобы краситель не подсыхал. Затем осторожно смывают краску водой и мазок в течение 15 — 30 с докрашивают фуксином Циля или сафранином. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. При правильной окраске кристаллы белка окрашиваются в черный, а клетки — в розовый цвет.
Белковые включения образуют и другие бактерии, например Вас111их рор1111ае, ХелойаЫия петаюрИ1т и др. Их окрашивают также по вышеописанной методике. Параспоральные тельца можно наблюдать и в живых клетках, используя фазово-контрастное устройство. В этом случае параспоральные тельца выглядят как гранулы, способные сильно прсломлять свет. 5.2.5. Эндоопоры Эндоспоры образуют бактерии родов Вас111ию, С1ояггийит и некоторых других. Для обнаружения способности клеток к спорообразованию лучше использовать старые культуры. Споры можно обнаружить при наблюдении живых клеток, а также путем дифференциального окрашивания цитоплазмы и споры. В случае выявления у микроорганизма способности к образованию спор необходимо обратить внимание на тип спорообразования (бациллярный, клострндиальный, плектридиальный), расположение споры в клетке (центральное, эксцснтральное или полярное), форму свободных спор (круглая, овальная или продолговатая) и определить их размеры.
С этой целью просматривают клетки 2 — 3-суточной культуры, так как большинство спорообразующих бактерий проходят за этот период времени все стадии развития — от вегетативной клетки до свободной споры. Наблюдение снорообразования в микрокультуре. На стерильном предметном стекле, как описано выше (см. 5.2.1), получают тонкую пленку агаризованной питательной среды, благоприятной для спорообразования (например, картофельного агара). В центр пленки наносят петлей каплю жидкой 24-часовой культуры Вас111их те8агеги~т или другой крупной спорообразующсй бактерии. Полученный препарат инкубируют при 37 С во влажной камере в течение 20 — 24 ч. Перед микроскопированием препарат подкрашивают метиленовым синим по Леффлеру и осторожно накладывают покровнос стекло.
Микроскопируют с иммерсией или методом фазового контраста. Просматривают край колонии, 80 обращая внимание на расположение клеток и на клетки в разных стадиях спорообразования. Наблюдение зндоспор в живых клетках. Споры по сравнению с цитоплазмой характеризуются более высоким показателем преломления света, поэтому при микроскопировании в светлом поле опи видны как более темные включения округлой или овальной формы. При использовании фазово-контрастного устройства споры имеют вид светлых включений на фоне почти черных клеток. Метод выявления спор негативным окрашиванием. На предметном стекле готовят тонкий мазок клеток спорулирующих бактерий, подсушивают на воздухе и фиксируют в пламени. Затем на 3 — 5 мин наносят метиленовый синий или на 1 — 3 мин фуксин, после чего препарат осторожно промывают водой и подсушивают на воздухе.
Просматривают с иммерсией. Вегетативные клетки бактерий прокрашиваются, а споры, имеющие многослойную, труднопроницаемую оболочку — нет. Они видны как сильно преломляющие свет сферические или овальные образования, находящиеся в зависимости от стадии спорообразования внутри или вне клеток бактерий. Иногда на поверхности спор откладывается тонкий белковый слой.
Благодаря его прокрашиванию споры становятся видимыми, но окрашены они значительно слабее, чем клетки. Например, при окраске фуксином Биля клетки красные, а споры светло-розовые. Метол удобен при количественной оценке процесса спорообразования путем подсчета количества спор и вегетативных клеток в разных условиях роста бактерий. Дифференциальная окраска споры п цитоплазмы по методу Пешкова. Споры и цитоплазму окрашивают при нагревании. Промывание препарата водой ведет к обесцвечиванию цитоплазмы, тогда как спора прочно удерживает краситель.
На обезжиренном предметном стекле готовят мазок, высушивают его на воздухе, фиксируют в пламени горелки и заливают раствором метиленового синего по Леффлеру. Краситель доводят до кипения, держа предметное стекло над пламенем горелки. По мере испарения красителя добавляют новые его порции. Продолжительность окраски, считая с момента закипания красителя, составляет 1Π— 20 с. Затем предметное стекло охлаждают, препарат тщательно промывают водой, после чего клетки в течение 30 с докрашивают 0,5%-м водным раствором нейтрального красного или сафранина. Краситель сливают, препарат промывают водой и просматривают с иммерсионной системой. При правильном окрашивании клетки имеют красный цвет, а споры — синий. Вместо метиленового синего можно использовать малахитовый зеленый. В этом случае препарат, фиксированный в пламени горелки, заливают на 7 — 1О мин 7,5%-м раствором малахитового зеленою.
Окрашивание проводят с подогревом, помещая препарат над пламенем горелки. По окончании окраски предметное стекло охлаждают, промывают препарат водой и докрашивают клетки 0,25%-м водным раствором сафрацина в течение 1 — 2 мин. Споры окрашиванхгся в зеленый цвет, клетки — в розовый. 5.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ Как уже отмечалось (см. 5.1.4)„некоторые микроорганизмы обладают собственной (первичной) люминесценцией, что связано с наличием в их клетках люминесцирующих веществ — хлорофилла, каротиноидов, рибофлавина, ал- калоидов, порфиринов, некоторых антибиотиков.
Такие микроорганизмы можно изучать с помощью люминссцентного микроскопа на препаратах «раздавленная капля», однако в большинсгве случаев применяется предварительная обработка клеток специальными красителями — флуорохромами, что приводит к вторичной люминесценции. Существуют природные и синтетические флуорохромы. Широко используются акридин оранжевый, этидиумбромид, примулин, родамин, берберинсульфат, Флуорескамин, аурофосфин и некоторые другие, избирательно концентрирующиеся на отдельных структурах клетки.
Флуорескамин выявляет аминогруппы, этидиумбромид — ДНК, фосфин ЗК— липиды. Калькофлуор белый образует соединения с хитином, целлюлозой и используется лля учета грибов в почве. Диацетилфлуоресцеин выявляет живые клетки. Особый интерес вызывает Флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), образующий связь с белками антител без нарушения их способности соединяться с гомологичными а~пигенами. Меченные ФИТЦ антитела представляют собой высокочувствительные индикаторы на соответствующие антигены. Антитела получают общепринятыми методами из крови иммунизированных кроликов и затем флуорохромируют. Кроме того, широко используются готовые, меченные флуорохромом определенные агггисыворотки, а также готовый комплекс ФИТЦ-у-глобулин.
Иммунофлуоресцентный анализ широко применяется в медицинской и санитарной микробиологии, генетике, систематике, экологии микроорганизмов. Препараты живых клеток. На предметное стекло в каплю раствора акридина оранжевого в воде или 0,5%-го МаС1 в разведении 1: 10" вносят исследуемую культуру микроорганизмов и накрывают покровным стеклом.
Через 2 — 1О мин микроскопируют при увеличении объектива 40к или 100к с вазелиновым маслом. Препараты фиксированных клеток. На предметном стекле готовят мазок, фиксируют и окрашивают нейтральным или слабокислым раствором акридина оранжевого в разведении 1: 10' в течение 2 — 4 мин. Затем препарат отмывают от избытка Флуорохрома слабопроточной водой из промывалки в течение 5— 10 мин, накрывают покровным стеклом и просматривают с объективом 90х. Иммуиофлуоресцентное окрашивание: прямой метод. На предметное стекло помещают суспензию клеток или образец, содержащий искомый микроорганизм, подсушивают и Фиксируют нагреванием или другим способом.
Препарат окрашивьчот меченной ФИТЦ антисывороткой, поместив его во влажную камеру (чашка Петри с мокрой филыровальной бумагой). Время взаимодействия подбирают опытным путем; обычно достаточно 20 мин. Затем препарат отмывают в стоячей или слабопроточной воде 2 — 3 мин, накрывают покровным сгеклом и исследуют с объективом 90х. Так как оболочка клетки непроницаема для аггп«тел, они адсорбируются на поверхности клетки и при этом возникает характерный «эффект ореола» как один из критериев специфичности.
Если в сыворотке есть несвязанный флуорохром, он, проникая в клетку, вызывает ее свечение вследствие неспецифической реакции. Иммунофлуореецентиое окрашивание (непрямой метод) включает два этапа. Сначала препарат фиксируют нагреванием, наносят каплю нелюминесцирующей гомологичной иммунной сыворотки определенного разведения и оставляют на 20 — 30 мин во влажной камере, затем осторожно промывают в течение 5 мин. На втором этапе на препарат наносят каплю меченого антикроличьего углобулина, разведенного до так называемого окрашивающего титра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
